美洲大蠊提取物Ento-A對濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的改善作用研究

張晶娜 陶磊 張俊 王木嶺 陳瑩 劉衡 張成桂 何苗

摘 要 目的：研究美洲大蠊提取物Ento-A對濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型大鼠的改善作用。方法：將70只大鼠隨機分為正常對照組（n=8）和造模組（n=62），造模組大鼠采用高糖高脂、辛辣飲食聯(lián)合2，4，6-三硝基苯磺酸灌腸法復(fù)制濕熱型UC動物模型。將造模成功的48只大鼠隨機分為模型對照組、美沙拉嗪組（300 mg/kg）、腸炎寧（300 mg/kg）和Ento-A低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg，以提取物計），每組8只。正常對照組和模型對照組大鼠灌胃生理鹽水，其余各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)給藥14 d。末次給藥后，對大鼠疾病活動指數(shù)（DAI）、結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）及病理組織學(xué)（HS）進(jìn)行評分，測定大鼠脾指數(shù)、肝指數(shù)和結(jié)腸指數(shù)，并采用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠血清中白細(xì)胞介素8（IL-8）、IL-17、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平和結(jié)腸組織中IL-2、前列腺素E2（PGE2）、髓過氧化物酶（MPO）水平。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組大鼠DAI評分、CMDI評分、HS評分、結(jié)腸指數(shù)以及血清中IL-8、IL-17、MDA水平和結(jié)腸組織中MPO、PGE2水平顯著升高（P<0.01），血清中SOD水平和結(jié)腸組織中IL-2水平顯著降低（P<0.01）。與模型對照組比較，Ento-A高劑量組大鼠DAI評分、CMDI評分及血清中IL-17、MDA水平和結(jié)腸組織中PGE2水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），血清中SOD水平和結(jié)腸組織中IL-2水平顯著升高（P<0.01）;Ento-A中劑量組大鼠CMDI評分、HS評分以及血清中IL-8、IL-17、MDA水平和結(jié)腸組織中PGE2、MPO水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），結(jié)腸組織中IL-2水平顯著升高（P<0.01）;Ento-A低劑量組大鼠HS評分以及血清中IL-17、MDA水平和結(jié)腸組織中MPO、PGE2水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），血清中IL-2水平顯著升高（P<0.01）。結(jié)論：美洲大蠊提取物Ento-A可能通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡、減少炎癥損傷，發(fā)揮其對濕熱型UC模型大鼠的改善作用。

關(guān)鍵詞 美洲大蠊;提取物;Ento-A;濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎;大鼠

中圖分類號 R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）01-0035-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.01.07

ABSTRACT OBJECTIVE：To study the improvement effect of Periplaneta americana extract Ento-A on damp-heat ulcerative colitis （UC） model rats. METHODS： Totally 70 rats were randomly divided into normal control group （n=8） and modeling group （n=62）. The damp-heat UC model was induced in modeling group by high sugar， high fat， spicy diet combined with 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid enema. 48 model rats were randomly divided into model control group， mesalazine group （300? ? ?mg/kg）， Changyanning group （300 mg/kg） and Ento-A low-dose， medium-dose and high-dose （50， 100， 200 mg/kg， calculated by the extract）， with 8 rats in each group. Normal control group and model control group were given normal saline intrsgastrically， and other groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 14 days. After last administration， disease activity index （DAI）， colonic mucosal injury index （CMDI） and histopathological score （HS） of rats were determined. The spleen index， liver index and colon index in rats were determined. The serum levels of IL-8， IL-17， SOD and MDA， colonic levels of IL-2， PGE2 and MPO were detected by ELISA.? RESULTS： Compared with normal control group， the DAI score， CMDI score， HS score， colonic index， the serum levels of IL-8， IL-17 and MDA， colonic levels of MPO and PGE2 were increased significantly （P<0.01）; serum level of SOD and colonic level of IL-2 were decreased significantly （P<0.01）. Compared with model control group， DAI score， CMDI score， serum levels of IL-17 and MDA， colonic levels of PGE2 were decreased significantly in Ento-A high-dose groups （P<0.05 or P<0.01）， while serum level of SOD and colonic level of IL-2 were increased significantly （P<0.01）. CMDI score and HS score， serum levels of IL-8， IL-17 and MDA， colonic levels of PGE2 and MPO were decreased significantly in Ento-A medium-dose group （P<0.05 or P<0.01）， while colonic level of IL-2 was increased significantly （P<0.01）. HS score， serum levels of IL-17 and MDA， colonic levels of MPO and PGE2 were decreased significantly in Ento-A low-dose group （P<0.05 or P<0.01）， while serum level of IL-2 was increased significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： P. americana extract Ento-A may play improvement effect on damp-heat UC rats by regulating immune system balance and reducing inflammatory damage.

KEYWORDS Periplaneta americana; Extract Ento-A; Damp-heat ulcerative colitis; Rat

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種病因尚未明確的累及直腸和結(jié)腸的慢性非特異性炎性疾病，臨床表現(xiàn)屬中醫(yī)泄瀉、腸澼、痢疾、臟毒等范疇[1]。中醫(yī)臨床將UC辯證分型為大腸濕熱型、脾虛濕蘊型、寒熱錯雜型、肝郁脾虛型、脾腎陽虛型和陰血虧虛型等，其中以大腸濕熱型居多[2]。其病因多是外感內(nèi)傷，濕熱或寒濕化熱客于腸腑，氣機不暢，通降不利，血行瘀滯，肉腐血敗，脂絡(luò)受傷而成內(nèi)瘍，發(fā)為瀉痢[3]。

美洲大蠊（Periplaneta americana L.）又稱蜚蠊，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為中品，味咸，性寒，入心、肝、脾、腎經(jīng)，具有活血散瘀、解毒消疳等功效[4]。提取物Ento-A由美洲大蠊經(jīng)水提醇沉后獲得，主要以氨基酸、核苷、多肽類物質(zhì)為主。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Ento-A具有增強免疫[5]、緩解噁唑酮誘導(dǎo)大鼠UC的作用[6]?；诿乐薮篌剐院乃幮裕捎糜跓嶙C疾病的治療。故本研究以濕熱證為切入點，通過高糖高脂、辛辣飲食聯(lián)合2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸法復(fù)制濕熱型UC大鼠模型，考察美洲大蠊提取物Ento-A對濕熱型UC模型大鼠的改善作用，為其應(yīng)用于中醫(yī)臨床的治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HC-30118R高速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）;AL204-IC電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];T6新世紀(jì)型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;201酶標(biāo)儀（奧地利安圖斯公司）;VORTFX-5渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;FD8-4a冷凍干燥機（美國Cold-Sim公司）;CX31普通光學(xué)顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

美沙拉嗪原料藥（深圳市麗晶生化科技有限公司，批號：20140925，純度：≥99%）;腸炎寧片（江西天施康弋陽制藥有限公司，批號：160303，規(guī)格：0.28 g）;老白干（瀘州老窖股份有限公司，批號：GB/T22045，酒精度：56%Vol）;蜂蜜（桂林周氏順發(fā)食品有限公司，批號：GB14923）;油脂（佛山市順德區(qū)三海食品貿(mào)易有限公司，批號：GB16752）;生理鹽水（貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：20150320）;前列腺素E2（PGE2）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號：R161002-002b）、白細(xì)胞介素2（IL-2）ELISA試劑盒（批號：R161001-001a）均購自深圳欣博生物科技有限公司;IL-17 ELISA試劑盒（批號：20161228）、IL-8 ELISA試劑盒（批號：20161022）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：20161031）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20160125）和髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（批號：20161022）均購自于南京建成生物科技有限公司。

1.3 動物

健康SD大鼠70只，SPF級，體質(zhì)量（200±20） g，♀♂各半，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2013-0004。健康家兔50只，♀♂不限，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，由大理大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滇）2011- 0004。本研究經(jīng)大理大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究均符合中國倫理委員會有關(guān)動物研究指導(dǎo)原則。

2 方法

2.1 美洲大蠊提取物Ento-A的制備

取美洲大蠊藥材5 kg，粉碎過20目篩，加水50 L，室溫浸泡過夜，在95 ℃下回流提取3次，每次3 h;收集提取液，過濾，濃縮至相對密度為1.10～1.20;加入95%乙醇，調(diào)節(jié)含醇量為50%～70%，攪拌30 min，靜置48 h，過濾，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.05～1.10，冷藏庫中放置24 h，棄去上層油脂，下層溶液過濾，濾液減壓濃縮至稠膏，即得美洲大蠊提取物Ento-A，其稠膏得率為13.3%。

2.2 抗原乳化劑的制備

參考文獻(xiàn)[7]方法，取新鮮家兔結(jié)腸50根，用冰生理鹽水沖洗干凈內(nèi)容物，使用蓋玻片刮取結(jié)腸黏膜組織，加入適量生理鹽水制成10%勻漿，于-20 ℃放置24 h，然后在4 ℃條件下以4 000 r/min離心30 min;取上清液，再于-20 ℃放置24 h，然后在4 ℃條件下以4 000 r/min離心30 min;取上清液，冷凍干燥成凍干粉，-20 ℃保存。臨用前配制抗原乳化劑，即精密稱取上述凍干粉（8 mg/只），以生理鹽水-完全弗氏佐劑（1 ∶ 1，V/V）為溶劑制備成80 mg/mL的乳化液（先將凍干粉完全溶解于相應(yīng)體積生理鹽水中，再加入相應(yīng)體積完全弗氏佐劑，渦旋混勻至乳化狀態(tài)）。

2.3 造模

將70只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后隨機選取8只作為正常對照組，進(jìn)行普通飼料喂養(yǎng)，其余62只大鼠進(jìn)行濕熱型UC造模。即在普通飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，喂以高糖高脂、辛辣飲食并聯(lián)合TNBS灌腸：造模大鼠每天自由飲用200 g/L蜂蜜水，第2天灌服油脂15 g/kg，并于灌服油脂的隔天灌服老白干20 mL/kg，交叉灌服造模持續(xù)20 d;于濕熱造模的第6天和第18天，制備抗原乳化劑，并于大鼠左側(cè)足趾、右側(cè)足趾、腹股溝、背部等多點皮下注射（1.0 mL/只），引起大鼠局部免疫反應(yīng);第21 天，造模大鼠禁食不禁水24 h后，異氟醚輕度麻醉，俯臥位，將連有直徑2.0 mm導(dǎo)管的注射器經(jīng)大鼠肛門輕輕插入至8 cm處，緩慢注入TNBS乙醇溶液（15 mg TNBS溶于300 mL/L乙醇溶液0.6 mL中），拔出導(dǎo)管，使大鼠保持倒立姿態(tài)10 s，完成造模[8]。正常對照組用生理鹽水代替TNBS乙醇溶液按上述方法平行操作。

2.4 分組與給藥

完成造模后第5 天，參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行疾病活動指數(shù)（Disease activity index，DAI）評分，并按炎癥的嚴(yán)重程度對大鼠進(jìn)行分層：0～3分，極輕度炎癥;4～6分，輕度炎癥;7～9分，中度炎癥;10～12分，重度炎癥[10]。剔除極輕度炎癥和重度炎癥的造模大鼠后，將剩余48只大鼠隨機分6組：即模型對照組、美沙拉嗪組（300 mg/kg，參考人臨床等效劑量并按動物體表面積法換算而得）、腸炎寧組（300 mg/kg，參考人臨床等效劑量并按動物體表面積法換算而得）和Ento-A低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg，以提取物計）[6]，每組8只（♀♂各半）。正常對照組和模型對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水（0.25 mL/100 g），其余各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物;每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。

2.5 指標(biāo)檢測

2.5.1 一般情況觀察和DAI評分 每天稱大鼠體質(zhì)量，觀察大鼠一般狀態(tài)及大便形狀。并于給藥第0、4、7、14 天進(jìn)行DAI評分[9]，計算每只大鼠的DAI分值評估疾病活動情況。

2.5.2 血清中IL-8、IL-17、SOD、MDA水平測定 腹主動脈采血，在4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，分離上層血清，按ELISA試劑盒操作檢測血清中IL-8、IL-17、SOD、MDA水平。

2.5.3 臟器指數(shù)測定 將大鼠處死，解剖后取出肝、脾和結(jié)腸，生理鹽水涮洗干凈后，用濾紙吸干表面水分，稱質(zhì)量，計算臟器指數(shù)：臟器（肝、脾、結(jié)腸）指數(shù)（mg/g）=臟器濕質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

2.5.4 結(jié)腸黏膜損傷情況評定 取結(jié)腸，沿腸系膜剪開，冰生理鹽水洗凈內(nèi)容物，平鋪于白瓷板上，量取結(jié)腸長度和寬度，并參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[11]方法進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷（Colonmucosa damage index，CMDI）評分。

2.5.5 結(jié)腸組織中IL-2、PGE2、MPO水平測定 將結(jié)腸縱向剪取一半，稱質(zhì)量，加適量冰生理鹽水勻漿制成10%組織勻漿液，以3 500 r/min離心10 min，取上清液，按相應(yīng)試劑盒方法操作檢測勻漿液中IL-2、PGE2、MPO水平。

2.5.6 結(jié)腸組織病理變化的檢查 將結(jié)腸縱向剪取一半，用10%中性福爾馬林固定，包埋，常規(guī)制作5 μm病理切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色后在顯微鏡下觀察其病理變化，并從上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤兩個方面進(jìn)行病理組織學(xué)（Histopathological score，HS）評分[12]。（1）上皮細(xì)胞：0分，正常形態(tài);1分，有杯形細(xì)胞丟失;2分，杯形細(xì)胞大面積丟失;3分，隱窩細(xì)胞丟失;4分，隱窩細(xì)胞大面積丟失。（2）炎性細(xì)胞浸潤：0分，沒有浸潤;1分，浸潤在隱窩基底層;2分，浸潤到達(dá)黏膜肌層;3分，浸潤深入到黏膜肌層，伴隨黏膜增厚和明顯水腫;4分，浸潤到達(dá)黏膜下層。每只大鼠的HS評分為“上皮細(xì)胞”評分+“炎性細(xì)胞浸潤”評分。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Ento-A對濕熱型UC模型大鼠一般情況的影響

正常對照組大鼠飲食正常，毛發(fā)光滑、潔白、干凈，精神狀態(tài)良好，體質(zhì)量增加，大便（黑色）和尿液均正常。模型對照組大鼠進(jìn)食減少，出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量減輕，毛發(fā)稀疏、松散無光澤，精神狀態(tài)差，出現(xiàn)拱背、扎堆等現(xiàn)象;隨著造模時間推移，大鼠糞便由黑色變?yōu)辄S色，且在灌油日松軟、潮濕，灌酒日干燥;在造模后期，部分大鼠肛周和尾巴底部覆蓋著黃色黏稠稀便，并伴有惡臭，尿液量減少且發(fā)黃，此癥狀符合臨床濕熱型UC患者腹瀉、里急后重、小便短赤的特點[2]。灌胃美沙拉嗪和腸炎寧后，大鼠精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，活動增多，未見黃色黏稠大便，糞便基本成型轉(zhuǎn)為黑色;灌胃低、中、高劑量Ento-A后，大鼠一般狀態(tài)有不同程度地改善，扎堆蜷臥現(xiàn)象減少，肛門污穢也減少，糞便基本成型且顏色轉(zhuǎn)為黑色，體質(zhì)量逐漸回升。

3.2 Ento-A對濕熱型UC模型大鼠DAI評分的影響

在給藥第0天時，各建模組大鼠DAI評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），并且均顯著高于正常對照組（P<0.01），這提示濕熱型UC模型建立成功且各建模組大鼠炎癥程度具有一致性。在給藥第4天時，大鼠DAI評分統(tǒng)計結(jié)果與給藥第0天時相似，但此時各給藥組大鼠DAI評分較給藥第0天時均有不同程度降低。在給藥第7、14天時，模型對照組大鼠DAI評分仍顯著高于正常對照組（P<0.01），但美沙拉嗪組、腸炎寧組（給藥第7、14天）以及Ento-A高劑量組（給藥第14天）大鼠DAI評分已顯著低于模型對照組，并且與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），這提示美沙拉嗪、腸炎寧以及Ento-A對濕熱型UC模型大鼠具有一定的改善作用。各組大鼠給藥不同時間后的DAI評分結(jié)果見表1。

3.3 Ento-A對濕熱型UC模型大鼠臟器指數(shù)的影響

各組大鼠的肝指數(shù)、脾指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與正常對照組比較，各建模組大鼠結(jié)腸指數(shù)均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與模型對照組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸指數(shù)雖有降低的趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果見表2。

3.4 Ento-A對濕熱型UC模型大鼠結(jié)腸長度、寬度及CMDI評分的影響

與正常對照組比較，模型對照組大鼠結(jié)腸長度略有縮短（P>0.05），結(jié)腸寬度顯著增加（P<0.01），CMDI評分也顯著升高（P<0.01）。與模型對照組比較，美沙拉嗪組和Ento-A各劑量組大鼠的結(jié)腸長度均不同程度增加，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;各給藥組大鼠的結(jié)腸寬度差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），且仍均顯著寬于正常對照組（P<0.01）;各給藥組大鼠結(jié)腸CMDI評分顯著降低（P<0.05或P<0.01），但仍顯著高于正常對照組（P<0.01）。與美沙拉嗪組比較，腸炎寧組和Ento-A中、高劑量組大鼠CMDI評分仍顯著升高（P<0.05），但腸炎寧組和Ento-A各劑量組大鼠間CMDI評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠結(jié)腸長度、寬度及CMDI評分結(jié)果見表3。

3.5 Ento-A對濕熱型UC模型大鼠血清中IL-8、IL-17、SOD、MDA水平的影響

與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清中IL-8、IL-17、MDA水平顯著升高（P<0.01），SOD水平顯著降低（P<0.01）。與模型對照組比較，美沙拉嗪組、腸炎寧組大鼠血清中IL-8、IL-17、MDA水平均顯著降低（P<0.01），SOD水平均顯著升高（P<0.01），但兩組大鼠血清中IL-8、IL-17水平仍顯著高于正常對照組（P<0.01）;Ento-A各劑量組大鼠血清中IL-17、MDA水平和Ento-A中劑量組大鼠血清中IL-8水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），Ento-A高劑量組大鼠血清中SOD水平顯著升高（P<0.01），并且Ento-A高劑量組大鼠血清中SOD水平和各給藥組大鼠血清中MDA水平與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與美沙拉嗪組比較，Ento-A各劑量組大鼠血清中IL-8水平和Ento-A高劑量組大鼠血清中IL-17水平仍顯著升高（P<0.05或P<0.01），Ento-A低、中劑量組大鼠血清中SOD水平仍顯著降低（P<0.01），其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與腸炎寧組比較，Ento-A各劑量組大鼠血清中IL-8水平和Ento-A高劑量組大鼠血清中IL-17水平同樣顯著升高（P<0.05或P<0.01），其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠血清中IL-8、IL-17、SOD、MDA水平測定結(jié)果見表4。

3.6 Ento-A對濕熱型UC模型大鼠結(jié)腸組織中IL-2、MPO、PGE2水平的影響

與正常對照組比較，模型對照組大鼠結(jié)腸組織中IL-2水平顯著降低（P<0.01），MPO、PGE2水平顯著升高（P<0.01）。與模型對照組比較，各給藥組大鼠血清中IL-2均顯著升高（P<0.05或P<0.01），但仍然顯著低于正常對照組（P<0.05或P<0.01）;除Ento-A高劑量組外，其余各給藥組大鼠結(jié)腸組織中MPO水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），并且與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;各給藥組大鼠結(jié)腸組織中PGE2水平均顯著降低（P<0.01），并且其中Ento-A中劑量組與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與美沙拉嗪組比較，Ento-A各劑量組大鼠結(jié)腸組織中IL-2水平顯著升高（P<0.05）。與腸炎寧組比較，Ento-A中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織中IL-2水平顯著升高（P<0.05）。各組大鼠結(jié)腸組織中IL-2、MPO、PGE2水平測定結(jié)果見表5。

3.7 Ento-A對濕熱型UC模型大鼠結(jié)腸黏膜病理變化的影響

正常對照組大鼠結(jié)腸各層結(jié)構(gòu)完整、清晰，腺體排列整齊，可見明顯的隱窩和杯狀細(xì)胞，基本無充血水腫、炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。模型對照組大鼠結(jié)腸黏膜表層脫落、缺損，隱窩和杯狀細(xì)胞大面積丟失，大量炎性細(xì)胞浸潤。各給藥組大鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞和隱窩均出現(xiàn)不同程度修復(fù)好轉(zhuǎn)，炎性細(xì)胞浸潤減少。與正常對照組比較，模型對照組大鼠上皮細(xì)胞評分、炎性細(xì)胞評分及HS評分均顯著升高（P<0.01）。與模型對照組比較，美沙拉嗪組和Ento-A低、中劑量組大鼠的上皮細(xì)胞評分、HS評分以及美沙拉嗪組、Ento-A中劑量組大鼠炎性細(xì)胞評分均顯著降低（P<0.05或P<0.01），并且美沙拉嗪組、Ento-A低劑量組、Ento-A中劑量組大鼠上皮細(xì)胞評分和美沙拉嗪組、Ento-A中劑量組大鼠炎性細(xì)胞評分以及Ento-A中劑量組大鼠HS評分與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與美沙拉嗪組比較，Ento-A各劑量組大鼠上皮細(xì)胞評分、炎性細(xì)胞評分及HS評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與腸炎寧組比較，Ento-A中劑量組大鼠上皮細(xì)胞評分顯著降低（P<0.05），其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠HS評分結(jié)果見表6，結(jié)腸組織病理切片圖見圖1。

4 討論

本研究采用飲食結(jié)合免疫復(fù)合的方法復(fù)制了與人臨床癥狀及腸道病變較為接近的濕熱型UC大鼠模型，此模型能達(dá)到全身免疫異常與局部炎癥病變結(jié)合，腸黏膜屏障損害與免疫調(diào)節(jié)失衡結(jié)合，是較理想的研究病理機制及中藥干預(yù)作用的中醫(yī)證候UC動物模型。本研究分別選取化學(xué)藥美沙拉嗪和中藥制劑腸炎寧為陽性對照藥。其中，美沙拉嗪作為臨床一線化學(xué)藥，其主要作用于腸道炎癥黏膜，對腸壁的炎癥有顯著的抑制作用;腸炎寧為臨床治療UC的常用中藥制劑，具有清熱利濕、行氣的作用，常用于大腸濕熱所致的泄瀉[13-14]。選擇以上兩個不同類型的藥為陽性對照，旨在從中藥和化學(xué)藥兩個層面進(jìn)行比較來評價Ento-A對濕熱型UC模型大鼠的改善作用。

UC以腹痛、腹瀉、黏液血便、里急后重為主要臨床表現(xiàn)，病變主要累及直腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸的黏膜層及黏膜下層，且病程遷延不愈[15]。在本研究中，大鼠造模后進(jìn)食減少，體質(zhì)量減輕，毛發(fā)稀疏松散、無光澤，精神狀態(tài)差，糞便呈黃色稀便，血便，并伴有惡臭，尿液量減少且發(fā)黃，DAI評分和CMDI評分均顯著升高（P<0.01）;病理組織檢查結(jié)果也顯示，結(jié)腸黏膜表層脫落缺損，隱窩和杯狀細(xì)胞大面積丟失，大量炎性細(xì)胞浸潤，HS評分顯著升高（P<0.01）。結(jié)合大鼠一般情況和病理檢查結(jié)果，建模后大鼠具備腹瀉黏液膿血便、里急后重2項主癥和小便短赤1項次癥，可認(rèn)為發(fā)生了濕熱型UC樣病變[16]。灌胃Ento-A后，大鼠精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，活動增多，體質(zhì)量回升，糞便基本成型且轉(zhuǎn)為黑色;且病理組織檢查結(jié)果也顯示，結(jié)腸杯狀細(xì)胞和隱窩均出現(xiàn)不同程度的修復(fù)，炎性細(xì)胞浸潤減少。以上結(jié)果提示，Ento-A可改善濕熱型UC模型大鼠的癥狀，修復(fù)腸黏膜損傷。

IL-2是由輔助性T淋巴細(xì)胞1型（Th1細(xì)胞）分泌的特征性細(xì)胞因子，其表達(dá)水平降低會引起T淋巴細(xì)胞免疫清除能力降低，進(jìn)而導(dǎo)致腸黏膜潰瘍形成[17]。IL-17為輔助性T淋巴細(xì)胞17（Th17 細(xì)胞）分泌的促炎因子，Th17 細(xì)胞可通過IL-17的促炎作用調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫[18]。通常認(rèn)為Th1與Th17介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相互拮抗[19]。本研究結(jié)果顯示，造模后大鼠血清中IL-17水平顯著升高、IL-2水平顯著降低，這與臨床上濕熱型UC患者血清中IL-17、IL-2水平的變化趨勢一致[20-21]。灌胃Ento-A后，大鼠血清中IL-17水平降低、IL-2水平升高，這提示Ento-A可能通過參與調(diào)節(jié)機體免疫功能發(fā)揮其對濕熱型UC模型大鼠的改善作用。

IL-8是一種炎性趨化性因子，可趨化并激活中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致溶酶體酶活性和吞噬作用增強，產(chǎn)生大量毒性物質(zhì)，加重腸道黏膜炎癥反應(yīng)[22]。PGE2能增加血管通透性，引起組織水腫，對白細(xì)胞有趨化、聚集作用，直接加重炎癥反應(yīng)[23]。MPO和白細(xì)胞計數(shù)通常是反映炎癥程度的重要指標(biāo)，MPO水平越高，則炎癥程度越高[24]。MDA是氧自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，可加重機體組織損害[25]。SOD 是機體天然存在的抗氧化酶，其含量高低間接反映機體清除氧自由基及促進(jìn)損傷組織修復(fù)的能力[26]。本研究結(jié)果顯示，灌胃Ento-A后，濕熱型UC模型大鼠血清中IL-8水平有降低的趨勢，PGE2、MPO及MDA水平均顯著降低（P<0.01），SOD水平顯著升高（P<0.01）。以上結(jié)果提示，Ento-A可降低促炎因子表達(dá)，調(diào)節(jié)機體活性氧的形成和抗氧化系統(tǒng)平衡，進(jìn)而改善濕熱型UC模型大鼠的癥狀。另外，Ento-A給藥后，部分測定指標(biāo)無劑量依賴性關(guān)系，即部分指標(biāo)在高劑量Ento-A給藥后變化反而不明顯。筆者推測可能原因有以下兩點：第一，Ento-A作為中藥提取物是多成分的復(fù)雜體系，人體則是更為復(fù)雜的生命系統(tǒng)，這就決定了中藥的藥效和作用機制具有復(fù)雜的非線性特征，表現(xiàn)出多成分、多層次、多靶點、多代謝途徑的特點;其次，Ento-A的主要成分為多肽類物質(zhì)，其經(jīng)口給藥后具有十分明顯的首關(guān)效應(yīng)，且蛋白多肽類藥物的吸收、結(jié)合和消除均可能涉及非線性飽和動力學(xué)的特點。后續(xù)筆者將通過灌腸或其他方式給藥，比較Ento-A對濕熱型UC大鼠的改善作用。

綜上所述，Ento-A對濕熱型UC模型大鼠具有一定的改善作用，其作用機制可能與參與調(diào)節(jié)機體免疫功能，減少炎癥因子生成，調(diào)節(jié)機體活性氧的形成和抗氧化系統(tǒng)平衡有關(guān)。

（致謝：感謝大理大學(xué)藥化學(xué)院藥理教研室陳俊雅實驗師、大理大學(xué)動物實驗中心吳定宇講師和楊琴講師及大理大學(xué)藥化學(xué)院2015級藥學(xué)本科生陳成、于躍、李伯隆、梁曼玉、張林飛對本課題組的支持?。?/p>

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 劉丹，李桂賢，王雪，等.中醫(yī)藥治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)雜志，2017，33（3）：167-169.

[ 2 ] 張聲生，沈洪，鄭凱，等.潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識意見（2017）[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（8）：3585- 3589.

[ 3 ] 劉經(jīng)州，馬東旺.潰瘍性結(jié)腸炎的中醫(yī)辨證及用藥研究[J].吉林中醫(yī)藥，2010，30（8）：665-667.

[ 4 ] 高潔，朱娟娟，劉瑾華，等.美洲大蠊提取物促組織修復(fù)作用機制研究進(jìn)展[J].四川動物，2019，38（2）：235-240.

[ 5 ] 唐苗，余萬鑫，吳桃清，等.美洲大蠊提取物Ento-A對免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2018，34（1）：72-76.

[ 6 ] 張漢超，張成桂，耿福能，等.美洲大蠊提取物Ento-A對噁唑酮致大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用研究[J].中藥材，2017，40（6）：1420-1424.

[ 7 ] 余萬鑫，張俊，唐苗，等. 康復(fù)新對濕熱型大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用及機制初探[J].中國藥學(xué)雜志，2018，53（11）：882-887.

[ 8 ] 葛曼青，巫玉蘭，陳軒.加味白頭翁湯灌腸液治療活動期濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠療效觀察[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2019，16（7）：934-938.

[ 9 ] ZHENG L，ZHANG YL，DAI YC，et al. Jianpi Qingchang decoction alleviates ulcerative colitis by inhibiting nuclear factor-kappaB activation[J]. World J Gastroenterol，2017，23（7）：1180-1188.

[10] 劉勝帥，王朋川，徐雨生，等.美洲大蠊提取物Ento-B對2，4-二硝基氯苯聯(lián)合醋酸誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用及機制初探[J].時珍國醫(yī)國藥，2018，29（10）：2313- 2316.

[11] YUW G，LU B，ZHANG HW，et al. Effects of the Sijunzi decoction on the immunological function in rats with dextran sulfate-induced ulcerative colitis[J]. Biomed Rep，2016，5（1）：83-86.

[12] 崔麗君.半夏瀉心湯免疫調(diào)節(jié)作用對BMSCs移植治療UC細(xì)胞定植狀態(tài)的影響[D].濟南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[13] 華宏軍，陳躍華，騰衛(wèi)軍.美沙拉嗪口服聯(lián)合灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎療效觀察[J].浙江臨床醫(yī)學(xué)，2013，15（8）：1192-1193.

[14] 馬麗，張妙紅，鄧青，等.腸炎寧浸膏粉對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型實驗研究[J].中南藥學(xué)，2014，12（4）：343-345.

[15] 劉巖，李連泰，計小清，等.黃芩-白芍藥對改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用及機制研究[J].中國藥房，2018，29（3）：356-360.

[16] 李軍祥，陳誩.潰瘍性結(jié)腸炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見（2017年）[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2018，26（2）：105-111，120.

[17] 古學(xué)文.潰瘍性結(jié)腸炎患者血清IL-2及sIL-2R濃度變化的研究[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2003，2（3）：153-155.

[18] 申青艷，譚海成，周滔，等.解毒化濕健脾法對實驗性潰瘍性結(jié)腸炎Th17細(xì)胞表達(dá)的作用[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2018，11（1）：2-6.

[19] 岳文杰，劉懿，徐薇，等.潰瘍性結(jié)腸炎（UC）腸黏膜中IL-2、IL-4、IL-17和IL-10的表達(dá)特點及其與疾病活動度的關(guān)系[J].復(fù)旦學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012，39（5）：454-459.

[20] 馬麗群，韓強，王波.清腸祛濕湯對潰瘍性結(jié)腸炎（大腸濕熱證）患者臨床癥狀的改善作用及免疫機制調(diào)節(jié)研究[J]. 四川中醫(yī)，2018，36（10）：112-114.

[21] 馮錦山，王士群，陳平湖，等.潰瘍性結(jié)腸炎患者血清IL-10、IL-13和IL-17水平與濕熱證關(guān)系研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24（5）：1261-1262.

[22] 孔梅，王鶯，邢長永.白頭翁湯干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎中性粒細(xì)胞凋亡、IL-8 研究[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2010，8（8）：1018-1820.

[23] 閆曙光，周永學(xué)，惠毅，等.烏梅丸拆方對TNBS誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎治療作用的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（4）：890-895.

[24] 時丹丹，王乾，謝培，等.半夏瀉心湯及其拆方對TNBS致潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子的影響[J].陜西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，41（5）：114-118.

[25] 柳越冬，陶弘武.加味通腑湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠超氧化物歧化酶和丙二醛影響的研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2017，35（4）：775-778.

[26] 張林，張偉，解嵐嵐，等.青柏潰結(jié)湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜SOD及MDA影響的研究[J].中國中醫(yī)急癥，2018，27（4）：630-632.

（收稿日期：2019-10-08 修回日期：2019-11-21）

（編輯：林 靜）