黃曦瑤, 汪惠麗

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

隨著經(jīng)濟的飛速發(fā)展,環(huán)境問題日益突出,危害著人類的身心健康。同時,隨著生活水平的提高,人們開始追求生活質(zhì)量的更高標準,致力于在日常的生活飲食中鞏固和改善自己的身體狀況。人體腸道內(nèi)生活著數(shù)百種、數(shù)十萬億種不同的微生物需要依靠人體才能存活,但同時也與寄主的健康狀況息息相關(guān)。而益生菌作為一種有益菌對腸道菌群的穩(wěn)態(tài)以及身體起到了積極的作用,因此也漸漸意識到益生菌帶給人們的有益作用。

工業(yè)生產(chǎn)、金屬冶煉、化肥殺蟲劑的使用等使得鉛(Pb)、鎘(Cd)、砷(As)和汞(Hg)等重金屬廣泛地分布于環(huán)境中[1-4]。環(huán)境中的重金屬嚴重影響土壤的壽命以及水生和陸生生物的生命,同時環(huán)境中的重金屬可以在土壤中富集，繼而被植物吸收蓄積于體內(nèi)最終通過食物鏈進入人體,從而損害機體健康[5-8]。其中鉛是一種多系統(tǒng)、多親和性的環(huán)境毒物,性質(zhì)穩(wěn)定且無安全劑量,可以影響包括神經(jīng)、造血和內(nèi)分泌等系統(tǒng)[9]。近年來,國內(nèi)外對鉛的神經(jīng)毒性的研究取得了一系列進展,如干擾神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞與神經(jīng)遞質(zhì)受體表達,引起氧化應(yīng)激,加劇海馬、紋狀體等區(qū)域細胞的死亡。除此以外,有文獻表明社會行為也是毒理學的效應(yīng)表征之一,且早期重金屬錳的暴露可導致小鼠的順從行為[10-12]。鉛暴露的毒性機制如今已在細胞、基因表達、分子水平等多個方面展開積極性的探索,但鉛與大鼠社會行為的研究目前較少,考慮到鉛的毒性作用，本文探究早期鉛暴露對大鼠社會行為的影響。

社會生活使動物易于獲得食物,增加自我繁殖,降低掠食風險,但也會導致個體過度與關(guān)鍵資源競爭[13-14]。同時激烈的攻擊行為也會讓個體花費更多的時間和精力,更有可能吸引掠食者,因此為避免此類風險,許多動物進化出明顯的等級制度以降低同種個體的攻擊行為，進而形成穩(wěn)定的優(yōu)勢——從屬關(guān)系[14]。動物社會等級因個體在種群內(nèi)的狀態(tài)及競爭者而存在較大的差異,社群經(jīng)歷、生活環(huán)境等因素均可制約動物的社會等級[15]。對于生命有機體來說,環(huán)境對動物的發(fā)育具有一定的影響,尤其是早期生活環(huán)境受損可能會使動物的大腦發(fā)育造成異常,進而影響個體后續(xù)的發(fā)展。

腸道微生物與人體共生且互相適應(yīng),腸道微生物的變化或失調(diào)影響機體功能,與一些疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),如腸道疾病、代謝性疾病、免疫性疾病、心血管疾病等,還能影響大腦發(fā)育和功能,如孤獨癥、阿爾茨海默病、帕金森綜合征等[16-17]。異常穩(wěn)態(tài)的機體可以通過重建體內(nèi)菌群的生態(tài)平衡來實現(xiàn)緩解和治療。有研究發(fā)現(xiàn)益生菌可以通過大腦以及中樞神經(jīng)對動物的行為產(chǎn)生一定的影響,但具體的機制尚不明確。因此本文旨在建立社會優(yōu)勢行為的表征模型,研究早期鉛暴露對大鼠社會行為的影響,并探究腸道益生菌攝入是否能夠修復早期鉛暴露引起的機體損傷。

1 材料方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

實驗所用的SD大鼠從安徽醫(yī)科大學動物實驗中心獲得,喂養(yǎng)在恒溫25 ℃,光照12 h,黑暗12 h的SPF級動物房內(nèi)。將發(fā)育期的母鼠設(shè)置為鉛組、鉛+益生菌組、益生菌組和空白對照組。所有的大鼠都能獲得同等標準的食物和水,子代大鼠在發(fā)育期通過母鼠獲取鉛(50 mg/L),斷奶之后通過飲水攝入鉛。益生菌通過單獨的容器給予(每只1010cfu/d),并保證大鼠在5 min內(nèi)取食完,待大鼠長至成熟期(PND 90)時開始進行動物行為學實驗(每組10只雄鼠)。各組大鼠的平均體質(zhì)量為413.09 g(空白對照組);414.75 g(鉛組);422.40 g(鉛+益生菌組);413.57 g(益生菌組)。

1.1.2 實驗器材及所用菌

透明籠子(50 cm×50 cm×50 cm),XR-XZ301自發(fā)活動曠場分析系統(tǒng)(上海欣軟信息技術(shù)有限公司)。益生菌(生合生物科技有限公司),其中包括嗜酸乳桿菌(LA1063)、鼠李糖乳桿菌(LRH10)、副干酪乳桿菌(LPC12)、嗜熱鏈球菌(ST30)、瑞士乳桿菌(LH43)、發(fā)酵乳桿菌(LF26)、長雙歧桿菌(BL986)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠編號

在大鼠幼年時使用不同的標記物在其尾巴上做標記,每組大鼠的編號為1～10。在大鼠90 d時進行稱重記錄,后續(xù)實驗進行配對,要求配對的2只大鼠體質(zhì)量之間的差異在10 g之內(nèi)。

1.2.2 公平條件下的社會競爭實驗

侵略行為是幾乎所有動物的自然行為之一,從生物學的角度來看,攻擊性行為可以被視為旨在主動控制社會環(huán)境的一種社交溝通方式。但是在與對手互動中進行的一系列典型性攻擊行為,如打擊侵略、身體沖突等不僅對受害者不利,而且對侵略者也有害。因此,動物群體中也漸漸進化出一種機制來最小化和控制身體攻擊,以防止其潛在的不利后果,如威脅行為。同樣的大鼠社會中,不同大鼠也常常為了爭奪領(lǐng)地、配偶等資源進行一定的威脅行為和攻擊行為,用來宣誓主權(quán)。因此為了探究大鼠社會競爭行為展開以下實驗。

籠子在使用前用酒精清洗消毒,然后將2只不同組別的大鼠放在籠子里,計時10 min,然后觀察10 min內(nèi)每只大鼠攻擊性行為發(fā)生的時間和次數(shù)(特征行為小于1 s的組別排除)。同時為了實驗的嚴謹性,大鼠的社會探索行為也需要被一并考量,作為對照。實驗中記錄大鼠的攻擊性行為包括站立、按壓、側(cè)面威脅、扭打、追逐;普通社會探索行為包括探索、聞氣味和梳毛等。

1.2.3 水剝奪實驗

為了更好地反映各組大鼠的社會行為差異,將大鼠生活環(huán)境中的一個資源剝奪一段時間后,通常大鼠為了搶奪資源,會表現(xiàn)出更加強烈的攻擊行為和搶奪行為,以此來觀察和判斷其社會競爭力。取走大鼠籠子里的水源,至少斷水24 h,然后將2只不同組的大鼠放到有水源的透明立方體籠子里,該水源1次只能讓1只大鼠飲用。觀察并記錄每只大鼠在10 min內(nèi)喝水的次數(shù)和喝水的時間,其中每次搶水成功和搶水失敗的情況也要記錄。該實驗重復3次,且每次實驗配對的老鼠都是相同的,目的是讓大鼠形成穩(wěn)定的社會秩序,以此來觀察每只大鼠的社會資源競爭力。

1.2.4 曠場實驗

曠場實驗主要是觀察實驗動物在全新環(huán)境中的自主探索行為、與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的焦慮度等,以及實驗動物在新奇環(huán)境之中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時間等,反應(yīng)實驗動物在陌生環(huán)境中的自主行為與探究行為。當大鼠進入到一個全新的、空曠的環(huán)境中,由于未知和緊張,一般會在環(huán)境的邊緣進行探索,然后逐漸向中心靠攏。如果大鼠長期在邊緣探索不向中間靠攏,那么表示該大鼠具有較高的焦慮度和緊張感。

大鼠曠場反應(yīng)箱高35 cm,底邊長100 cm,內(nèi)壁全黑,底面平均分為16個小方格,正上方1.5 m處安裝一數(shù)碼攝像頭,使其視野可覆蓋整個曠場內(nèi)部。在安靜的環(huán)境下,將大鼠逐個放在開口的黑色木盒里,同時進行攝像和計時。每只大鼠接受1次測試,將小鼠面朝墻放入4個拐角方格之一,并讓其自由探索環(huán)境5 min。每次實驗后清洗方箱內(nèi)壁及底面,以免上次實驗動物余留的信息(如動物的大小便、氣息)影響下次實驗結(jié)論,之后更換動物繼續(xù)實驗。記錄和觀察大鼠在邊緣和中間區(qū)域的時間、速度、行走路程等,同時還包括潛伏期、周邊時間、直立次數(shù)(2只前爪離地)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實驗采用SPSS軟件進行分析,結(jié)果采用“均值±標準差”來表示。分析組間差異時采用T-test和One-way ANOVA方法進行,ns 表示無顯著性差異；*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。

2 結(jié) 果

2.1 公平條件下的社會競爭實驗

2.1.1 鉛暴露導致大鼠表現(xiàn)出從屬性行為特征

實驗結(jié)果通過計算不同行為類別的分數(shù)來獲得,即總進攻得分:側(cè)面威脅、直立、扭打、壓制和追逐的總和;總探索評分:社交探索、生殖器嗅探和社交行為的總和。統(tǒng)計每只大鼠在籠子里的社會優(yōu)勢特征行為次數(shù),并計算10 min內(nèi)每只大鼠不同行為與總觀察時間的百分比,分析其顯著性。記錄的行為參數(shù)應(yīng)覆蓋觀察時間的100%,這有利于更加公正地解釋結(jié)果。

將每次實驗的同組大鼠的特征行為相加進行整體分析,可以觀察到不同組的普遍情況而并非個體。所有數(shù)據(jù)整理后的結(jié)果如圖1所示。

圖1 慢性鉛暴露導致大鼠表現(xiàn)出從屬性行為特征

從圖1可以看出,空白對照組的社會優(yōu)勢行為所占比例顯著高于鉛暴露組，表明生命早期持續(xù)的鉛暴露嚴重損傷了大鼠在社會等級中的競爭能力,而整體上表現(xiàn)出從屬性的行為特征。

2.1.2 益生菌攝入修復鉛鼠的從屬性行為特征

本文研究益生菌是否能夠修復鉛鼠的從屬性行為特征如圖2所示。

圖2 益生菌攝入改善鉛暴露大鼠的從屬性行為特征

從圖2可以看出,腸道益生菌的攝入能夠明顯修復鉛鼠在社會等級競爭中的弱勢地位,并且能夠修復到與空白對照組差不多的水平。表明益生菌攝入可以修復慢性鉛暴露大鼠的從屬性行為。

2014年，國務(wù)院發(fā)布實施《珠江-西江經(jīng)濟帶發(fā)展規(guī)劃》，提出要把北江等重要干支流航道和支撐保障系統(tǒng)加快建設(shè)。隨后廣東省把北江定位為建設(shè)21世紀海上絲綢之路的延伸加快開發(fā)，于2014年啟動大宗貨物綠色運輸北江示范項目，同年8月啟動北江千噸級航道擴能升級工程建設(shè)，項目總投資約70億元。其中在孟洲壩、濛浬、白石窯、飛來峽、清遠等五處水利樞紐，新建復線船閘共7座，清遠樞紐二線船閘將于2019年4月建成投入使用，其它船閘主體工程將于2021年前先后完工。正式拉開加快內(nèi)河水運發(fā)展、建設(shè)黃金水道的序幕。

2.2 水剝奪實驗

2.2.1 鉛削弱大鼠在資源剝奪實驗中的地位

為了進一步驗證鉛暴露確實能夠?qū)е麓笫笤谏鐣?yōu)勢行為中的競爭能力,本文對大鼠進行水剝奪實驗。2只大鼠在缺水的情況下會互相爭搶水源,占有水資源更久的一方則表現(xiàn)更加強勢。統(tǒng)計每組大鼠的喝水時間相加占總喝水時間的百分比,結(jié)果如圖3所示。

圖3 鉛暴露大鼠在資源剝奪實驗中的表現(xiàn)

從圖3可以看出,第1次實驗時2組大鼠的喝水時間占比并無顯著性差異,而在第2、3次實驗時,由于各組老鼠在實驗之前是分籠飼養(yǎng)的,彼此之間還未存在等級關(guān)系,而在經(jīng)過實驗形成社會秩序和等級,使得空白對照組的喝水時間占比逐漸增多。實驗結(jié)果表明，早期鉛暴露能夠影響大鼠在資源剝奪實驗中的競爭能力。

2.2.2 益生菌攝入改善鉛鼠在資源剝奪中地位

之前的實驗表明早期鉛暴露削弱大鼠在資源剝奪實驗中的競爭能力,接下來本文探究益生菌的腸道攝入是否能夠改善這種現(xiàn)象,結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出,第1次和第2次實驗時2組大鼠的喝水時間占比并無顯著性差異,但是在第2天的實驗中鉛+益生菌組具有優(yōu)于鉛組的趨勢,同時在第3天時社會等級已經(jīng)形成,因此在喝水時間上體現(xiàn)出顯著的差異。

圖4 益生菌攝入對改善鉛暴露大鼠的競爭能力影響

2.3 曠場實驗

研究表明某些社會行為與焦慮情緒表現(xiàn)出明顯關(guān)系,本文擬進一步對上述實驗條件下SD大鼠的焦慮行為進行檢測,以確定早期鉛暴露影響的是大鼠的社會優(yōu)勢行為而非焦慮情緒。統(tǒng)計每組小鼠進入曠場中心區(qū)域的數(shù)據(jù)如圖5所示。

圖5 鉛暴露與益生菌攝入對大鼠焦慮情緒的影響

由圖5a可知,進入中心區(qū)域探索的時間,即從大鼠身體2/3進入中心區(qū)域開始計算大鼠在中心區(qū)域活動的總時間;由圖5b可知,潛伏時間即大鼠從進入曠場到第1次進入中心區(qū)域時經(jīng)歷的時間;由圖5c可知,進入中心區(qū)域的次數(shù)即大鼠在5 min內(nèi)總共進入中心區(qū)域的次數(shù)。

從圖5可以看出,鉛暴露以及益生菌的攝入對大鼠的焦慮情緒無顯著影響,表明早期鉛暴露與益生菌攝入對大鼠社會行為的影響與其焦慮無關(guān)。

3 討 論

生活環(huán)境的破壞對動物的生長發(fā)育都有著十分不利的影響,尤其是早期生活環(huán)境受損可能會使動物的大腦發(fā)育造成異常。已有實驗發(fā)現(xiàn)早期重金屬暴露增加成年動物自閉癥行為,早期飲用水鉛等重金屬的暴露可導致后代行為的缺陷,多次行為異常,且這種情況會持續(xù)到成年。有研究表明發(fā)育期鉛暴露能導致多動癥的發(fā)生,損傷大鼠神經(jīng)系統(tǒng)[18-19]。

腸道微生物與機體健康息息相關(guān),能夠促進腸道的消化吸收、代謝和免疫等[20-21],同時也與某些疾病的發(fā)生有關(guān)。在本文研究中,早期鉛暴露會對大鼠社會優(yōu)勢行為造成影響,腸道微生物的改變可能是其影響機制。這種影響具體表現(xiàn)為:早期鉛暴露影響大鼠的社會優(yōu)勢行為,表現(xiàn)為在群體里的活躍度不高、較為膽小,與其他大鼠斗爭時也表現(xiàn)出較為弱勢的一面。而益生菌的攝入可以恢復鉛暴露對大鼠社會優(yōu)勢行為的影響。這種恢復過程可能是大鼠通過長期食用益生菌使得腸道微生物調(diào)整,這種調(diào)整通過神經(jīng)系統(tǒng)影響大腦,促進了大鼠特定腦區(qū)神經(jīng)元的改變和生長,從而使得大鼠的社會行為恢復。

綜上,益生菌給宿主帶來的好處不僅是腸胃的健康,還會給其大腦、神經(jīng)系統(tǒng)帶來很大的幫助。但是益生菌影響神經(jīng)系統(tǒng)的具體機制依然有待探究,如益生菌攝入后定殖于腸道的具體位置;其改善機體健康的分子機制,影響大腦的分子路徑;起作用的是菌體本身還是其代謝產(chǎn)物等問題都亟待解決。