劉 偉,周勁松,寇 博

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院血管外科,西安 710061;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖與組胚系;3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科;*通訊作者,E-mail:492526094@qq.com;#共同通訊作者,E-mail:zjs301@mail.xjtu.edu.cn)

腎細(xì)胞癌是最為常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其在人類所有腫瘤中占據(jù)2%-3%[1]。隨著診療水平的不斷提高改善,腎癌患者的生存期逐年提高,但仍有30%的腎癌患者在手術(shù)治療后存在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn),近年來靶向治療在腎癌的治療中取得不錯(cuò)的療效,但其仍存在低效性、耐藥性等問題[2]?；诖?探尋新的診療靶點(diǎn)顯得極為重要。

高遷移率族蛋白A1(high mobility group A1,HMGA1)屬于高遷移率族蛋白家族中的一員,是一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白。有文獻(xiàn)報(bào)道HMGA1參與并影響細(xì)胞進(jìn)化的進(jìn)程,如細(xì)胞周期的調(diào)控、衰老、DNA修復(fù)等[3]。其在胚胎組織中的表達(dá)較高,而在成熟組織細(xì)胞內(nèi)呈低表達(dá),甚至不表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),HMGA1在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá),且與腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-6]。本研究基于Cancer Browser數(shù)據(jù)庫,分析HMGA1與腎癌分級分期、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)以及預(yù)后的關(guān)系,進(jìn)而揭示HMGA1基因?qū)δI癌診療及預(yù)后的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析

從Cancer Browser數(shù)據(jù)庫檢索renal cell carcinoma,下載并提取有關(guān)腎癌的臨床參數(shù)資料以及基因表達(dá)(TCGA-KIRC-exp-HiSeqV2-2015-02-24),隨后檢索關(guān)鍵詞“HMGA1”,提取并篩選HMGA1在腎癌中的基因表達(dá)資料,最后通過GraphPad 8.0軟件分析HMGA1與腎癌分級分期、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)以及預(yù)后的關(guān)系。

1.2 主要試劑與細(xì)胞培養(yǎng)

人腎癌組織及癌旁正常組織、腎小管上皮細(xì)胞HK2、腎癌ACHN、Caki、769-P細(xì)胞系均由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室所提供,1640-DF12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清均來自美國Gibco公司,單克隆抗體HMGA1、Twist1、Twist2和β-actin購自美國Cell Signaling Technology公司。

正常腎小管上皮細(xì)胞HK2和腎癌細(xì)胞系均用含10%胎牛血清的1640-DF12培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基內(nèi)含青霉素(100 U/ml)及鏈霉素(100 U/ml),細(xì)胞置于含5%CO2的37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng),間隔2 d定期傳代換液。

1.3 Western blot檢測HMGA1、Twist1、Twist2蛋白的表達(dá)

腎癌組織、癌旁正常組織或腎小管上皮細(xì)胞HK2、腎癌ACHN、Caki、769-P細(xì)胞先用RIPA裂解液充分裂解,隨后離心、提取上清液并進(jìn)行蛋白定量。然后取25 μg變性蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后,分別加入HMGA1、Twist1、Twist2和β-actin蛋白一抗(稀釋比例均為1 ∶1 000),4 ℃恒溫孵育過夜。經(jīng)TBST液洗脫后,室溫下孵育羊抗鼠或者羊抗兔二抗(稀釋比例1 ∶1 000)1 h。PVDF膜再次用TBST液洗脫,然后用顯影液(美國Bio-Rad公司)顯影,通過Image Lab成像軟件(美國Bio-Rad公司)進(jìn)行圖像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選用GraphPad 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析,用t檢驗(yàn)檢測兩組間的差異表達(dá),并用相關(guān)性分析探究HMGA1與腎癌臨床相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性,然后用Kaplan-Meier檢驗(yàn)分析HMGA1表達(dá)與腎癌預(yù)后的關(guān)系,將P<0.05看作差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGA1基因表達(dá)與腎癌分級分期的相關(guān)性

選用Cancer Browser數(shù)據(jù)庫分析HMGA1基因的表達(dá)與腎癌grade分級、stage分期的相關(guān)性,獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)分析及相關(guān)性分析顯示,HMGA1的基因表達(dá)與腎癌的grade分級、stage分期均呈正相關(guān)關(guān)系(見圖1),且Spearman秩相關(guān)系數(shù)分別為0.307 0,0.179 9,均P<0.000 1。

2.2 HMGA1基因表達(dá)與腎癌臨床TNM分期的相關(guān)性

利用Cancer Browser數(shù)據(jù)庫分析HMGA1基因的表達(dá)與腎癌TNM分期的相關(guān)性,獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)分析及相關(guān)性分析顯示,HMGA1基因的表達(dá)量與腎癌的T分期呈正相關(guān),且T3、T4期腎癌中的HMGA1基因表達(dá)是顯著高于T1期的(P<0.05和P<0.000 1,見圖2)。隨后發(fā)現(xiàn)HMGA1與腎癌的N和M分期亦表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見圖2)。而HMGA1基因與腎癌T、N、M分期相關(guān)性的Spearman秩相關(guān)系數(shù)分別為0.166,0.217 6,0.167 0,均P<0.001。

與G1或stageⅠ比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1圖1 利用Cancer Browser數(shù)據(jù)庫分析HMGA1基因表達(dá)量與腎癌臨床分級、分期的相關(guān)性Figure 1 Correlation analysis of HMGA1 gene expression and clinical grade and staging of renal cell carcinoma patients based on Cancer Browser

與T1或N0或M0比較,*P<0.05,***P<0.001,****P<0.000 1圖2 利用Cancer Browser數(shù)據(jù)庫分析HMGA1基因的表達(dá)量與腎癌TNM分期的相關(guān)性Figure 2 The correlation analysis of HMGA1 gene expression and TNM stage of renal cell carcinoma patients based on Cancer Browser

2.3 HMGA1在腎癌中的表達(dá)

通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腎癌組織中HMGA1的表達(dá)高于其在癌旁正常組織內(nèi)(見圖3),且腎癌Caki-1、ACHN細(xì)胞系中HMGA1表達(dá)亦高于其在正常腎小管上皮細(xì)胞HK2內(nèi)的表達(dá)(見圖3)。這提示HMGA1在腎癌中呈現(xiàn)異常高表達(dá)。

T:腎癌組織;N:癌旁正常組織圖3 Western blot檢測HMGA1在腎癌組織以及細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)Figure 3 The protein levels of HMGA1 in the renal cell carcinoma tissues and the cell lines by Western blot

2.4 HMGA1基因表達(dá)與腎癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)的相關(guān)性

利用Cancer Browser數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn),在腎癌中,HMGA1的基因表達(dá)與Twist1無顯著相關(guān)性,而HMGA1與Twist2的表達(dá)呈正相關(guān)(見圖4A)。隨后Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示相較于HK2細(xì)胞系,腎癌ACHN細(xì)胞系中HMGA1與Twist2呈高表達(dá),而兩組間的Twist1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4B)。

A.利用Cancer Browser數(shù)據(jù)庫檢測HMGA1與Twist1、Twist2在腎癌中表達(dá)的相關(guān)性 B.Western blot實(shí)驗(yàn)檢測腎癌細(xì)胞內(nèi)蛋白水平

圖4 HMGA1基因表達(dá)與腎癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)的相關(guān)性

Figure 4 Correlation between HMGA1 gene expression and epithelial-mesenchymal transition markers in renal cell carcinoma

2.5 HMGA1表達(dá)與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系

隨后我們進(jìn)一步挖掘HMGA1表達(dá)與腎癌患者預(yù)后的臨床資料,分析并繪制了HMGA1高低表達(dá)的生存曲線圖,結(jié)果提示HMGA1高表達(dá)的腎癌患者總體生存期顯著低于HMGA1低表達(dá)組的患者(χ2=7.113,P=0.007 7,見圖5)。

圖5 HMGA1基因表達(dá)與腎癌患者預(yù)后的相關(guān)性Figure 5 Correlation between HMGA1 gene expression and prognosis of renal cell carcinoma patients

3 討論

諸多證據(jù)顯示,HMGA1在乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種不同腫瘤中呈高表達(dá),且影響腫瘤的惡性進(jìn)程[7-9]。文獻(xiàn)報(bào)道,HMGA1可通過調(diào)控c-myc的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胃癌的致癌性[4]。也有研究發(fā)現(xiàn),HMGA1在子宮內(nèi)膜癌中被視作一種潛在的不良預(yù)后因子[10]。本研究利用Cancer Browser數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),HMGA1的基因表達(dá)與腎癌的grade分級、stage分期以及TNM分期呈正相關(guān)關(guān)系,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明HMGA1在腎癌的惡性進(jìn)程中扮演著重要角色。

Takaha等[11]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),HMGA1在腎癌細(xì)胞中呈高表達(dá),且敲低HMGA1可抑制腎癌的克隆形成能力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制腎癌的侵襲遷移能力。因此為了進(jìn)一步驗(yàn)證HMGA1在腎癌中表達(dá),本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HMGA1在腎癌組織及部分腎癌細(xì)胞系內(nèi)的蛋白表達(dá)顯著高于其在癌旁正常組織及腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。這進(jìn)一步提示HMGA1在腎癌中可能扮演著原癌基因的角色。而近些年有研究報(bào)道HMGA1與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。Liu等[12]學(xué)者發(fā)現(xiàn)HMGA1通過ILK/Akt/GSK3β信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲能力。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)下調(diào)HMGA1可抑制非小細(xì)胞肺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[6]。本研究利用Cancer Browser數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),HMGA1的基因表達(dá)與Twist2呈正相關(guān),而與Twist1無明顯相關(guān)。隨后的Western blot實(shí)驗(yàn)亦證實(shí),HMGA1與Twist2在腎癌細(xì)胞內(nèi)均呈高表達(dá),而Twist1的表達(dá)無明顯變化。這進(jìn)一步提示HMGA1與腎癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有著密切關(guān)聯(lián)。而生存分析發(fā)現(xiàn),高表達(dá)HMGA1常常提示腎癌患者的不良預(yù)后。但HMGA1與其他上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)的關(guān)系尚不清楚,且HMGA1對腎癌細(xì)胞侵襲遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用亦不明確,這都有待于后續(xù)體外研究的進(jìn)一步證實(shí)。

總而言之,HMGA1可能是腎癌診斷和預(yù)后的一種潛在生物學(xué)標(biāo)志物,后續(xù)還需要更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。