吳寶升，張崇志△，桑 丹，李勝利，張春華，金 鹿，斯登丹巴，谷 英，孫海洲*

(1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2. 鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

日糧營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)妊娠期母體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成和代謝改變起著至關(guān)重要作用，妊娠期營(yíng)養(yǎng)不良導(dǎo)致母體動(dòng)員自身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以確保胎兒正常的生長(zhǎng)發(fā)育。然而，當(dāng)母體所提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法滿(mǎn)足胎兒正常的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(IUGR)[1]。IUGR不僅影響動(dòng)物初生重，阻礙胎兒生長(zhǎng)發(fā)育，而且與出生后的高發(fā)病率和死亡率密切相關(guān)，造成家畜養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失[1]。

Wu等[2]研究發(fā)現(xiàn)，IUGR和胚胎損失是在人和其他哺乳動(dòng)物中的突出問(wèn)題。在養(yǎng)羊業(yè)中，由胚胎或胎兒死亡導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失非常大，胚胎或胎兒死亡數(shù)量約占30%[3]，其中在母羊妊娠期18 d至分娩階段胎兒死亡損失率約占9.4%[4]。母羊胚胎或胎兒死亡主要發(fā)生在妊娠早期識(shí)別、受精卵附植、胎盤(pán)的發(fā)育等關(guān)鍵窗口期[5]，其中妊娠早期的受精卵在子宮內(nèi)附植和胎盤(pán)形成與生長(zhǎng)發(fā)育是胎兒程序化發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，此階段對(duì)繁殖母羊受胎率和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的影響非常大。N-氨甲酰谷氨酸(NCG)作為內(nèi)源精氨酸生成激活劑，能夠通過(guò)促進(jìn)谷氨酰胺或脯氨酸合成瓜氨酸，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)源性精氨酸的合成，日糧添加NCG不僅可有效促進(jìn)內(nèi)源精氨酸合成，達(dá)到調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)分配的作用，也能有效降低繁殖母畜胚胎損失、提高胎兒出生重及母畜繁成率[6-9]。谷氨酰胺和精氨酸在母畜妊娠期的胚胎、胎盤(pán)和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，能夠通過(guò)AMPK、cGMP和mTOR等信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)底物氧化和蛋白質(zhì)合成[6]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于NCG對(duì)母羊妊娠前期營(yíng)養(yǎng)調(diào)控方面的研究甚少，因此，本試驗(yàn)在日糧中添加不同劑量的NCG，研究NCG對(duì)妊娠前期鄂爾多斯細(xì)毛羊子宮內(nèi)膜層及胎兒發(fā)育的影響，為鄂爾多斯細(xì)毛羊妊娠期繁殖性能的提高提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇體況良好，2～3周歲，平均體重為(50.62±0.52)kg的受孕鄂爾多斯細(xì)毛羊母羊40只隨機(jī)分為3組：試驗(yàn)組13只，試驗(yàn)2組13只，對(duì)照組14只。各組試驗(yàn)?zāi)秆蝮w重經(jīng)t檢驗(yàn)差異均不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)于鄂爾多斯細(xì)毛羊妊娠期開(kāi)始至妊娠期第90 d結(jié)束，整個(gè)試驗(yàn)期90 d。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理

飼喂NRC(2007)推薦的基礎(chǔ)日糧(滿(mǎn)足妊娠雙胎母羊需要量為26.2 g/kg體重)，再與不同濃度NCG進(jìn)行混勻，每只母羊單獨(dú)套袋飼喂，準(zhǔn)確記錄供給飼喂量和剩料量。日糧的營(yíng)養(yǎng)組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。40只試驗(yàn)?zāi)秆螂S機(jī)分為3組，NCG1組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.30 g NCG/d(n=13),NCG2組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.40 g NCG/d(n=13)，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧(n=14)。每日上午8:00和下午17:00飼喂兩次，自由飲水。NCG添加劑量參考李金霞[10]前期的試驗(yàn)結(jié)果。每天清掃羊圈、清除糞便、清洗飲水池，確保周?chē)h(huán)境的清潔。

1.3 取樣方法

妊娠期第0 d、45 d和90 d，對(duì)試驗(yàn)?zāi)秆蜻M(jìn)行稱(chēng)重，根據(jù)體重變化及時(shí)調(diào)整母羊的日糧供給量。在妊娠期第45 d和90 d，分別每組3只母羊進(jìn)行屠宰，立即取出子宮、剝離尿囊絨膜和羊膜，用50 ml注射器抽取尿囊液和羊水并測(cè)量體積。記錄胎盤(pán)及附屬物重、胎兒體重、體高、體長(zhǎng)、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、胰腺、腎臟及腎周?chē)局?；妊娠期?7 d，每組3只母羊進(jìn)行屠宰采集子宮內(nèi)膜；妊娠期第90 d，采集腎脂肪組織，保存-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.4 基因mRNA表達(dá)量的測(cè)定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定子宮內(nèi)膜及腎脂肪組織中相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量。根據(jù)由GenBank中公布的序列利用Primer5.0設(shè)計(jì)特異性引物，綿羊子宮內(nèi)膜及腎脂肪組織中相關(guān)基因：骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、整合素αvβ3(alpha v beta 3 integrin,Integrinαvβ3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)、過(guò)氧物酶體增殖激活受體γ輔激活因子1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha,PGC-1α)、PR結(jié)構(gòu)域蛋白16(PR domain-containing 16,PRDM16)、解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein 1,UCP-1)由大連寶生物工程有限公司合成并驗(yàn)證，β-actin作為內(nèi)參基因，引物信息見(jiàn)表2。從-80 ℃冰箱中取出子宮內(nèi)膜及腎脂肪組織，分別剪取0.5 g 左右，用RNA isoPlus 提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定光密度(OD值)，計(jì)算OD260/280和OD260/230。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司，PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser)反轉(zhuǎn)錄mRNA 為cDNA，使用熒光定量PCR儀(illumina Eco)SYBRGreen 法檢測(cè)mRNA的表達(dá)量，參數(shù)設(shè)置：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

注：①每千克預(yù)混料成分：Fe(FeSO4·7H2O)170 g；Cu(Cu SO4·5H2O)70 g；Mn(MnSO4·5H2O)290 g；Zn(ZnSO4·7H2O)240 g；Co(CoCl2·6H2O)510 mg；KI 200 mg；NaSeO3130 mg；VA1620 000 IU；VD3324 000 IU；VE 540 IU；VK3150 mg；VB120.9 mg；VB5450 mg；泛酸鈣 750 mg；葉酸 15 mg。

Note：①Composition of per kg of the premix：Fe(FeSO4·7H2O)170 g；Cu(Cu SO4·5H2O)70 g；Mn(MnSO4·5H2O)290 g；Zn(ZnSO4·7H2O)240 g；Co(CoCl2·6H2O)510 mg；KI 200 mg；NaSeO3130 mg；VA1620 000 IU；VD3324 000 IU；VE 540 IU；VK3150 mg；VB120.9 mg；VB5450 mg；Calcium pantothenate 750 mg；folic acid 15 mg.

表2 引物信息表

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用SAS9.0一般線(xiàn)性模型統(tǒng)計(jì)分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±SEM表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCG對(duì)母羊體重及妊娠相關(guān)器官的影響

由表3可知，妊娠期第0 d和45 d，對(duì)照組、NCG1組和NCG2組母羊體重沒(méi)有顯著差異；妊娠期第90 d，NCG2組母羊體重最高，達(dá)到61 kg，但與對(duì)照組和NCG1組母羊體重差異不顯著。由表4可知，妊娠期第45 d和90 d，NCG2組和NCG1組母羊羊水和尿囊液含量高于對(duì)照組，但差異不顯著；妊娠期第45 d，NCG2組母羊胎盤(pán)及附屬物重高于對(duì)照組和NCG1組，妊娠期第90 d，對(duì)照組母羊胎盤(pán)及附屬物重高于NCG2組和NCG1組(P>0.05)。

表3 妊娠前期母羊體重變化情況

注：同行數(shù)據(jù)肩注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，相鄰字母表示差異顯著(P<0.05)，相隔字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note: In the same row, values with the same letter superscripts mean insignificant difference (P>0.05), adjacent letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and separate letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)．The same below.

表4 日糧中添加不同劑量的NCG對(duì)母體羊水、尿囊液和胎盤(pán)及其附屬物重的影響

2.2 NCG對(duì)胎兒體重、體尺及各器官重的影響

由表5可知，妊娠期第90 d，NCG1組胎兒的肺臟顯著高于對(duì)照組，NCG2組胎兒的肝臟顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 NCG對(duì)母羊子宮內(nèi)膜及胎兒腎脂肪組織相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由表6可知，妊娠期第17 d，NCG1組母羊子宮內(nèi)膜OPN基因表達(dá)顯著高于NCG2組(P<0.05)和對(duì)照組(P<0.01)，NCG2組母羊子宮內(nèi)膜Integrinαvβ3基因表達(dá)高于NCG1組(P>0.05)、顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表5 日糧中添加不同劑量的NCG對(duì)胎兒體重、體尺和器官重的影響

表6 妊娠期17 d母羊子宮內(nèi)膜層相關(guān)基因表達(dá)量的變化

由表7可知，妊娠期第90 d，NCG1組(P<0.01)和NCG2組(P>0.05)胎兒腎脂肪PGC-1α基因表達(dá)量低于對(duì)照組，NCG2組(P<0.01)和NCG1組(P>0.05)胎兒腎脂肪PRDM16基因表達(dá)量低于對(duì)照組；而NCG2組和NCG1組胎兒腎脂肪BMP7基因(P<0.05)和UCP-1基因(P<0.01)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。

表7 妊娠期90天胎兒腎脂肪相關(guān)基因表達(dá)量的變化

3 討 論

3.1 NCG對(duì)母羊體重及妊娠相關(guān)器官的影響

綿羊的妊娠期長(zhǎng)度平均為147 d，其中胎兒和胎盤(pán)的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間不同，孕體發(fā)育過(guò)程中母體代謝程序化與胎兒發(fā)育程序化之間息息相關(guān)[11-12]。母羊妊娠期前50 d是胚胎形成、胎兒器官生成和增生階段，此時(shí)胚胎和孕體營(yíng)養(yǎng)需要量較少，但是胎兒的代謝率和生長(zhǎng)率都很高；妊娠期第50～90 d是胎盤(pán)生長(zhǎng)的最快階段，妊娠期第80 d胎盤(pán)生長(zhǎng)達(dá)到最大值，其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生較大變化以增強(qiáng)自身的容量、營(yíng)養(yǎng)素和氣體的轉(zhuǎn)運(yùn)能力[13-14]。Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸對(duì)母畜妊娠期的胚胎、胎盤(pán)和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。在本試驗(yàn)中，妊娠前期(0～90 d)日糧添加不同劑量的NCG對(duì)鄂爾多斯細(xì)毛羊體重、胎盤(pán)及其附屬物重沒(méi)有顯著的影響(P>0.05)，然而，日糧添加不同劑量的NCG在妊娠期45 d和90 d都有增加羊水和尿囊液含量的趨勢(shì)(P>0.05)， 這可能由于日糧中NCG的添加改變了羊水和尿囊液中的物質(zhì)代謝反應(yīng)[16]。

3.2 NCG對(duì)胎兒體重、體尺及各器官重的影響

胎兒或胚胎死亡主要發(fā)生在妊娠期前18 d的妊娠識(shí)別和受精卵著床期，妊娠早期母畜補(bǔ)充0.4% NCG可以有效促進(jìn)黃體形成，降低胚胎死亡率[17]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，妊娠前期(0～90 d)日糧添加不同劑量的NCG有效促進(jìn)鄂爾多斯細(xì)毛羊胎兒的生長(zhǎng)和發(fā)育，胎兒體重、體長(zhǎng)、體高、心臟、脾臟、腎臟、胰腺、腎周?chē)揪憩F(xiàn)為增加的趨勢(shì)(P>0.05)，其中NCG1組胎兒肺臟重和NCG2組胎兒肝臟重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在妊娠前期，胎兒肝臟重的增加能夠提高機(jī)體代謝活動(dòng)并促進(jìn)糖異生途徑，使胎兒對(duì)葡萄糖的利用率最大化，同時(shí)，胎兒的肝臟和腎臟可以提供更多的葡萄糖來(lái)維持自身生長(zhǎng)和發(fā)育[18]。也有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠前期母體營(yíng)養(yǎng)對(duì)胎兒腎臟、肺臟和肝臟等較晚成熟的器官發(fā)育的具有重要影響，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相似[19]。

3.3 NCG對(duì)母羊子宮內(nèi)膜相關(guān)基因表達(dá)量的影響

在胚胎移植試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，孕體必須在發(fā)情周期的12或13 d內(nèi)移植到子宮，目的是讓母體能夠在胚胎移植之后獲得懷孕成功，在孕體移除的母羊懷孕前13 d的發(fā)情周期不變，然而移除那刻起對(duì)黃體壽命延長(zhǎng)到了17 d[20]。母羊妊娠識(shí)別開(kāi)始于妊娠期第12～13 d，胚胎在子宮內(nèi)的附植是在妊娠期第17～20 d，胚胎附植的過(guò)程是極其復(fù)雜的，不僅需要P4和IFNT等一系列激素，還需要Integrin αvβ3、OPN等蛋白的潛在調(diào)控作用。OPN 及其受體Integrinαvβ3可能是啟動(dòng)胚胎附植級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要因子，在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、附植及分化等方面起著重要作用[21]。胚胎的附植、胎盤(pán)形成和胎兒胎盤(pán)生長(zhǎng)發(fā)育需要孕體通過(guò)妊娠識(shí)別信號(hào)來(lái)維持和建立穩(wěn)定的子宮內(nèi)環(huán)境，以維持黃體分泌孕酮的功能[22]。 Kim等[23]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中Integrin與OPN相結(jié)合的現(xiàn)象，OPN結(jié)合受體Integrinαvβ3通過(guò)激活滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的黏附、遷移和細(xì)胞骨架重塑相關(guān)信號(hào)通路，使孕體的增殖和延伸拉長(zhǎng)以及植入順利完成胚胎的附植。也有研究發(fā)現(xiàn)，在懷孕女性的子宮內(nèi)發(fā)現(xiàn)受體Integrinαvβ3的表達(dá)，當(dāng)改變其表達(dá)后女性出現(xiàn)不孕癥，此階段為胚胎植入窗口期[24-25]。最初孕體在子宮-胎盤(pán)表面附著和植入的時(shí)候需要胚胎植入窗口期的Integrinαvβ3與OPN相互密切結(jié)合。本試驗(yàn)中，妊娠前期日糧添加不同劑量的NCG顯著提高了母羊子宮內(nèi)膜層OPN和Integrinαvβ3的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，說(shuō)明日糧中添加不同劑量的NCG能夠促進(jìn)OPN和Integrinαvβ3在子宮內(nèi)膜層的表達(dá)，OPN和Integrinαvβ3主要通過(guò)激活mTOR信號(hào)刺激孕體的遷移、增生和發(fā)育[23]。

3.4 NCG對(duì)胎兒腎脂肪組織相關(guān)基因表達(dá)量的影響

饑餓和寒冷環(huán)境是羔羊死亡的主要因素，初生羔羊死亡最主要是體溫過(guò)低造成的[26]。動(dòng)物腎臟周?chē)暮稚窘M織(brown adipose tissue, BAT)能夠通過(guò)氧化脂肪酸來(lái)產(chǎn)熱，在寒冷環(huán)境中維持體溫，為新生羔羊提供代謝產(chǎn)熱的脂肪，有效確保羔羊適應(yīng)子宮外環(huán)境的挑戰(zhàn)和預(yù)防體溫過(guò)低癥狀[27]。在新生羔羊體內(nèi)，BAT大約占整個(gè)脂肪組織的80%，妊娠前期羔羊體內(nèi)BAT迅速貯存，出生時(shí)沉積速度降低[27]，約占出生體重的2%。BAT能夠以非顫抖性產(chǎn)熱方式提供新生羔羊約50%的熱量[28]，所以增加胎兒BAT沉積對(duì)潛在提高新生兒產(chǎn)熱機(jī)制和生存能力具有重要作用[29]。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠前期增加母體營(yíng)養(yǎng)能夠促進(jìn)胎兒BAT的生長(zhǎng)和發(fā)育，BAT通過(guò)UCP-1快速地為新生兒釋放熱量，增強(qiáng)子宮外環(huán)境的適應(yīng)能力，提高出生羔羊的存活率[30]。也有研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸促進(jìn)棕色的蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)脂肪細(xì)胞前體細(xì)胞是通過(guò)mTOR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[31]，在妊娠第100～140 d母體灌注精氨酸能增加胎兒腎臟周?chē)鶥AT沉積[32]。作為BAT線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的一種組織特異性很高的UCP-1能夠引起線(xiàn)粒體氧化呼吸的電子傳遞和ATP產(chǎn)生偶聯(lián)作用，以降低脂肪酸氧化代謝的產(chǎn)能效率，大量能量以熱能的形式散發(fā)，經(jīng)過(guò)BAT豐富的血管被輸送到動(dòng)物機(jī)體各個(gè)部分[33]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，妊娠前期日糧添加不同劑量的NCG顯著提高了胎兒腎周?chē)鶥AT中UCP-1(P<0.01)和BMP7(P<0.05)的mRNA表達(dá)量。BMP7在BAT細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，BMP7能夠強(qiáng)烈激活p38MAPkinase 和下游的ATF-2，并通過(guò)PGC-1α來(lái)激活UCP-1的表達(dá)，線(xiàn)粒體的生成[34]。然而，NCG2組胎兒腎周?chē)鶥AT中PRDM16(P<0.01)和NCG1組胎兒腎周?chē)鶥AT中PGC-1α(P<0.01)的mRNA表達(dá)量顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏PGC-1α的動(dòng)物體內(nèi)BAT形態(tài)變化很小，但UCP-1表達(dá)量偏低，對(duì)冷刺激敏感[35]。通過(guò)BAT體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，PGC-1α的表達(dá)不會(huì)影響B(tài)AT的形成，只會(huì)影響產(chǎn)熱功能，所以說(shuō)，PGC-1α是調(diào)控適應(yīng)性產(chǎn)熱的主要分子，并不是BAT形成的決定性分子[33]。等于或者低于生理水平的PRDM16能夠促進(jìn)BAT細(xì)胞的形成，但PRDM16的缺失會(huì)阻礙BAT細(xì)胞的分化，過(guò)表達(dá)可顯著增加BAT細(xì)胞的數(shù)量[36]。本試驗(yàn)條件下，NCG1組和NCG2組高表達(dá)的UCP-1(P<0.01)和BMP7(P<0.05)、以及低表達(dá)的PRDM16是促進(jìn)鄂爾多斯細(xì)毛羊胎兒腎周?chē)鶥AT沉積的關(guān)鍵基因，BAT沉積還受到其他諸多因子的一系列的調(diào)控，調(diào)控BAT細(xì)胞形成的信號(hào)也不確定，其調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，妊娠前期日糧中添加NCG有效促進(jìn)了鄂爾多斯細(xì)毛羊妊娠識(shí)別、早期胚胎定植和子宮內(nèi)膜層發(fā)育，保障了胎兒早期程序化生長(zhǎng)。