李方舟，李 宇，張利坤，杜燁青，溫 飛，陳美杰，胡建宏*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

精子在保存過程中不斷代謝，會產(chǎn)生超氧陰離子、過氧化物、ROS、NO等產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可使精子發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，嚴(yán)重影響精液保存質(zhì)量[1]。因此，稀釋液中常添加一些高效抗氧化劑，以抑制精子脂質(zhì)氧化程度，減少精子損傷。葡萄籽原花青素是植物來源中至今發(fā)現(xiàn)抗氧化性最高的物質(zhì)之一。劇紅梅等[2]報道稱，葡萄籽原花青素參與了磷酸與花生四烯酸的代謝過程、蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)，因而能夠降低細胞脂質(zhì)過氧化程度，從而減少細胞損傷；金文泉[3]研究表明，葡萄籽原花青素的抗氧化性可達VC的20倍、VE的50倍，可有效清除羥基自由基、超氧陰離子自由基。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗試劑 精液基礎(chǔ)稀釋液(詳見1.3.1稀釋液配制)、葡萄籽原花青素、碘化丙啶(PI)、羅丹明123、姬姆薩染液、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒。

1.1.2 精液樣品的采集 試驗精液來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)畜禽生態(tài)養(yǎng)殖場的西農(nóng)薩能奶山羊。公羊年齡2～3歲，體況良好且無生殖系統(tǒng)疾病。采精完畢后，先根據(jù)顏色、氣味選擇正常精液放入保溫杯中，1 h內(nèi)帶回實驗室。37 ℃下顯微鏡鏡檢，選擇精子活率≥0.8 的精液用于試驗。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)一個空白對照組，四個試驗處理組?？瞻捉M為基礎(chǔ)稀釋液，四個處理組在基礎(chǔ)稀釋液中分別添加濃度10、30、50、70 mg/L的葡萄籽原花青素。將空白組及各處理組稀釋液稀釋精液后于4 ℃冰箱低溫保存。于0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d檢測精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率；第0 d、1 d、3 d、5 d檢測精子線粒體活性；1 d、3 d、5 d檢測精子T-AOC、MDA。

1.3 試驗方法

1.3.1 稀釋液配制 基礎(chǔ)稀釋液配制：葡萄糖1.15 g，D-果糖1.45 g，PVA 0.25 g，EDTA 0.23 g，檸檬酸鈉1.17 g，碳酸氫鈉0.125 g，100 mL雙蒸水溶解。青霉素10萬IU，鏈霉素10萬IU，卵黃20%現(xiàn)用現(xiàn)配?？寡趸瘎┨砑樱簩⒒A(chǔ)稀釋液分為5組，向每組稀釋液中分別添加濃度0、10、30、50、70 mg/L的葡萄籽原花青素，在37 ℃水浴鍋水浴30 min。水浴后室溫冷卻，放置4 ℃冰箱中低溫保存。

1.3.2 精液的稀釋 采精前將卵黃、抗生素分別加入各試驗組稀釋液中，封好口，置于37 ℃水浴鍋中保溫。采精后，將檢查合格的精液平均分為5份，再分別按照精液：稀釋液=1∶8的比例同溫稀釋。采取逐漸稀釋法進行(操作時須把稀釋液沿著管壁緩慢加入到各組精液中)，先用精液和稀釋液1∶1 稀釋(搖勻)，進一步再做精液與混合液1∶3 稀釋(搖勻)，使精液和稀釋液比例最終達到1∶8。稀釋結(jié)束后檢測各組精液質(zhì)量指標(biāo)(0 d)，然后用厚毛巾包裹盛有稀釋后精液的離心管，放入4 ℃冰箱保存。保存過程中注意每隔12 h輕搖精液，防止精液沉積在離心管底部；每24 h從各試驗組取樣檢測保存后相關(guān)指標(biāo)。

1.4 精液質(zhì)量指標(biāo)檢測

1.4.1 精子活率測定 輕搖精液混勻，用移液槍吸取精液 1 mL于離心管中，放入水浴鍋中緩慢升溫至37 ℃，37 ℃下再水浴1 min，然后吸取精液10 μL滴到載玻片(有37 ℃恒溫加熱板)上，制片，用顯微鏡觀察5個視野的精子直線運動狀況，各視野至少保證有200個精子，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.2 質(zhì)膜完整率測定 用分析天平按照檸檬酸鈉濃度 7.35 g/L、果糖濃度13.5 g/L，準(zhǔn)確稱取檸檬酸鈉和果糖，然后溶于雙蒸水中，制成檸檬酸鈉-果糖低滲溶液。分別將各組稀釋后保存的精液1 mL，與9 mL 低滲液混合，置于37 ℃水浴鍋中水浴30 min，注意水浴期間需要輕晃試管，避免精子沉積。水浴結(jié)束后，吸取15 μL精液，滴于載玻片制片。顯微鏡下先于40倍下找到精子，后于400倍下觀察精子彎尾現(xiàn)象，計算彎尾率(觀察重復(fù)5次，每次不少于200個精子)。

1.4.3 頂體完整率測定 用姬姆薩染色法進行精子頂體完整率檢測。從各試驗組吸取精液30 μL，滴于載玻片上制片，使其風(fēng)干5 min；然后吸取福爾馬林溶液滴于風(fēng)干的精液上，并要完全覆蓋；30 min后將載玻片置于蒸餾水下，沖洗，再風(fēng)干；再吸取姬姆薩溶液滴對精子染色，2 h后用蒸餾水洗去多余浮色，再次風(fēng)干；最后將載玻片置于1000倍顯微鏡下鏡檢，觀察頂體狀態(tài)并計算精子頂體完整率，共觀察5個視野，每個視野精子數(shù)不少于200個。

1.4.4 線粒體活性測定 將1 μL PI 貯存液和1 μL Rh123 貯存液混合放入試管，避光靜置10 min，將精液用等溫稀釋液稀釋，調(diào)整精子密度。然后移液槍吸取50 μL精子加入上述避光放置的PI + Rh123 混合液中，靜置30 min，吸取10 μL 滴于載玻片，置于熒光顯微鏡(400×)下觀察檢測，各試驗組重復(fù)觀察五個視野，每個視野至少有200個精子。

1.4.5 T-AOC、MDA測定 T-AOC與MDA的檢測采用南京建成生物科公司的試劑盒進行。按說明書操作，分別測定空白對照組與不同濃度蘋果多酚試驗組與不同濃度葡萄籽原花青素試驗組的精液在1、3、5 d時的T-AOC和MDA值，記錄數(shù)值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗所記錄數(shù)值用SPSS 22.2統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，計算各試驗組中數(shù)據(jù)的顯著性，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示，P<0.05代表差異顯著，P>0.05代表差異不顯著，每個試驗組5個重復(fù)。T-AOC、MDA畫圖用origin軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄籽原花青素對低溫保存的山羊精子活率的影響

根據(jù)表1可知，葡萄籽原花青素濃度為10、30、50 mg/L的處理組均可不同程度提高山羊精子活率。濃度為30 mg/L的處理組中精子活率最高，在2、3、4、5 d時均顯著高于其余各組(P<0.05)。50 mg/L處理組次之，在3、4、5 d時均顯著高于除30 mg/L組外的其他組(P<0.05)。70 mg/L處理組效果最差，1、2、3、4 d均顯著低于其他處理組(P<0.05)。

表1 葡萄籽原花青素對低溫保存的山羊精子活率的影響

注：同行數(shù)據(jù)中小寫字母不同代表差異顯著(P<0.05)，相同代表差異不顯著(P>0.05))。下同。

Note:Different lowercase superscripts in the same row indicate significant difference(P<0.05),same letter superscripts in the same row indicate insignificant difference(P>0.05).The same blow.

2.2 葡萄籽原花青素對低溫保存的山羊精子質(zhì)膜完整率的影響

根據(jù)表2可知，葡萄籽原花青素濃度為10、30、50、70 mg/L的處理組中山羊精子質(zhì)膜體完整率均大于空白對照組。其中30 mg/L處理組精子質(zhì)膜完整率最高，其在保存后2、3、4、5 d顯著高于50 mg/L處理組之外的其余各組(P<0.05)。

2.3 葡萄籽原花青素對低溫保存的山羊精子頂體完整率的影響

由表3可知，在3、4、5 d時葡萄籽原花青素濃度為10、30、50、70 mg/L的處理組中精子頂體完整率均顯著大于空白對照組(P<0.05)。其中30 mg/L處理組對精子頂體完整率提高的效果最好，其在保存中后期(3、4、5 d)顯著高于其余各組(P<0.05)。

表2 葡萄籽原花青素對低溫保存的山羊精子質(zhì)膜完整率的影響

表3 葡萄籽原花青素對低溫保存的山羊精子頂體完整率的影響

2.4 葡萄籽原花青素對低溫保存的山羊精子線粒體活性的影響

根據(jù)表4可知，葡萄籽原花青素濃度為10、30、50、70 mg/L的處理組中精子線粒體活性都較對照組有所提升。其中30 mg/L處理組中精子線粒體活性最好，在3、5 d時均顯著高于其余各組(P<0.05)。50 mg/L 處理組次之，5 d時顯著高于除30 mg/L外其他各組(P<0.05)。

2.5 蘋果多酚與葡萄籽原花青素對低溫保存的山羊精子T-AOC的影響

葡萄籽原花青素濃度30 mg/L處理組的精子T-AOC最高，在保存期間均顯著高于其余各組(P<0.05)，50 mg/L處理組次之，T-AOC在保存期間顯著高于除30 mg/L之外各試驗組(P<0.05)。其他各組之間在保存3、5 d時均有顯著差異，精子T-AOC含量由高到低為50 mg/L>10 mg/L>70 mg/L>0 mg/L。

2.6 蘋果多酚與葡萄籽原花青素對低溫保存的山羊精液MDA含量的影響

葡萄籽原花青素濃度10、30、50、70 mg/L處理組的精液MDA含量，在保存期間均顯著低于空白對照組(P<0.05)其中30 mg/L處理組的精液MDA含量最低，在保存期間均顯著低于其余各組(P<0.05)。

表4 葡萄籽原花青素對低溫保存的山羊精子線粒體活性的影響

圖2 葡萄籽原花青素對低溫保存的山羊精液MDA含量的影響

3 討 論

在低溫保存過程中，精子會隨著保存時間的逐漸變長而產(chǎn)生大量的自由基。自由基是一種能獨立存在的活潑的化學(xué)實體，常見的有超氧陰離子自由基、羥自由基、一氧化氮自由基等[4]。在機體內(nèi)，自由基對生物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞程序性死亡、細胞分化分裂等具有重要作用。但活性氧自由基一旦過量時，則會發(fā)生氧化應(yīng)激，損傷細胞蛋白與細胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，還會導(dǎo)致基因突變，加速細胞死亡[5]。生物膜中脂質(zhì)部分包含有大量不飽和脂肪酸，自由基對不飽和脂肪酸上的氫有很強的攻擊性；另外，一些金屬離子如Fe2+等會促進氧化作用，這些因素使得細胞膜很容易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[6]。因此，精液保存過程中，當(dāng)ROS大量積累超過一定濃度后，會攻擊含有大量不飽和脂肪酸的精子膜，使精子發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。同時，ROS 也會攻擊頂體膜，使頂體酶提前釋放而不能進行頂體反應(yīng)，降低受精率，嚴(yán)重影響精子保存質(zhì)量[7-8]。

原花青素是普遍存在于植物中的一類有強大清除自由基能力的物質(zhì)，而葡萄籽是原花青素的較好來源[9]。本試驗通過向低溫保存稀釋液中添加葡萄籽原花青素，檢測保存過程中精子各項質(zhì)量指標(biāo)，結(jié)果顯示山羊精液品質(zhì)得到顯著提高，這表明葡萄籽原花青對低溫保存的山羊精子具有保護作用，這可能與葡萄籽原花青素的結(jié)構(gòu)及其保護機理有關(guān)。一方面，葡萄籽原花青素屬于斷鏈型抗氧化劑，在反應(yīng)鏈進行過程中，其結(jié)構(gòu)中的酚羥基會在氧化后釋放，優(yōu)先與自由基進行結(jié)合，使自由基惰化而終止反應(yīng)，減少脂質(zhì)受損[10]；另一方面，葡萄籽原花青素可與有金屬螯和，從而減少氧化反應(yīng)發(fā)生[11]。孫蕓等[12]在評價葡萄籽原花青素的抗氧化效果時發(fā)現(xiàn)，其抗氧化效果比VC、VE強數(shù)倍。郭英等[13]在大鼠離體組織中做葡萄籽原花青素抗氧化性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠組織中MDA含量明顯下降。另有研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素可有效提高細胞中SOD、CAT活性[14-15]。Busserolles等[16]在大鼠飼養(yǎng)中飼喂了葡萄籽原花青素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠的血漿中T-AOC明顯增強。上述研究均與本試驗結(jié)果一致。

本試驗中，葡萄籽原花青素的最適添加濃度為30 mg/L。孫艷青[17]在豬凍精保存中探索葡萄籽原花青素的添加濃度，結(jié)果表明葡萄籽原花青素最佳添加濃度為40 mg/L。劉斌[18]在豬精液常溫保存中添加不同濃度葡萄籽原花青素，結(jié)果最適濃度為50 mg/L。上述研究雖然都證實葡萄籽原花青素對精子保存有著顯著的改善作用，但最適添加濃度與本研究均有所不同，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因可能在于，一是保存方式與稀釋液成分的不同。本試驗中，精液的保存方式分別為常溫保存、低溫保存、冷凍保存。其中常溫保存稀釋液中添加的成分相對較少，也缺少抗凍保護劑[19]。低溫保存會對精子產(chǎn)生一定的冷打擊，稀釋液成分中也含有其他保護物質(zhì)，對精子同樣會產(chǎn)生影響。而精液冷凍保存過程最為復(fù)雜，除了常規(guī)稀釋外，還需離心去漿、冷凍、升溫等多項操作，同時稀釋液成分也更加復(fù)雜，常包含多種抗凍保護劑[20]。不同的保存方式與稀釋液配方均會對精液保存產(chǎn)生很大的影響，因而造成結(jié)果不統(tǒng)一。二是本試驗與其余二者研究對象不同，而不同動物精液受不同抗氧化劑的影響不同，因此導(dǎo)致最適添加量略有差異。

4 結(jié) 論

在基礎(chǔ)液中添加一定濃度的葡萄籽原花青素，可以有效提高山羊精液低溫保效果，其適宜添加濃度為30 mg/L。