宋嘉賓　端木德強(qiáng)

摘要：以百脈根結(jié)瘤因子受體激酶LjNFR1為誘餌，通過建立百脈根根瘤共生不同時(shí)期的酵母膜雙雜文庫篩選獲得了一個(gè)與之互作的生長(zhǎng)素相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Lj5NG4。通過酵母雙雜交和煙草Split-Luc等試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Lj5NG4與LjNFR1的蛋白互作。利用CRISPR-Cas9基因敲除及超表達(dá)技術(shù)創(chuàng)建相關(guān)轉(zhuǎn)基因材料，研究發(fā)現(xiàn)Lj5NG4可能在根瘤菌侵染前期起負(fù)調(diào)控作用，但對(duì)結(jié)瘤過程沒有顯著影響。同時(shí)啟動(dòng)子表達(dá)也證實(shí)了Lj5NG4在侵染前期根毛中強(qiáng)烈表達(dá)，成熟根瘤內(nèi)部不表達(dá)。外源施加生長(zhǎng)素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度的生長(zhǎng)素會(huì)減弱Lj5NG4突變體的早期侵染表型，這表明生長(zhǎng)素在共生結(jié)瘤發(fā)育中通過Lj5NG4發(fā)揮功能。

關(guān)鍵詞：百脈根;根瘤菌侵染;LjNFR1;Lj5NG4;生長(zhǎng)素

中圖分類號(hào)：Q789 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）05-0145-07

Abstracts： Using the Lotus japonicus nodule factor receptor kinase LjNFR1 as a bait and a yeast membrane two hybrid library constructed with transcripts harvested at different stages of nodule symbiosis， we identified an auxin related transporter protein Lj5NG4. The interaction between Lj5NG4 and LjNFR1 was further confirmed by yeast two hybrid and Split-Luc experiments. Using CRISPR-Cas9 and overexpression technology， we conclude that Lj5NG4 may play a negative regulatory role in the early stage of rhizobial infection， but had no significant effect on nodule formation. Meanwhile， promoter expression also confirmed that Lj5NG4 was strongly expressed in root hairs at the early stage of infection， but not in inner mature nodules. Exogenously applied auxin treatment showed that low concentration of auxin weakened the phenotype of Lj5NG4 mutant， indicating that auxin plays a role in the development of symbiotic nodules.

Key words： Lotus japonicus; rhizobium infection; LjNFR1; Lj5NG4; auxin

豆科植物特異性地與根瘤菌共生導(dǎo)致在植物根部形成新的器官，稱為根瘤。根瘤細(xì)胞內(nèi)分化的根瘤菌可以將空氣中的N2固定并轉(zhuǎn)化為氨交換宿主植物的碳水化合物。根瘤菌感知豆科植物產(chǎn)生的黃酮類化合物時(shí)分泌結(jié)瘤因子（Nodulation factor，NF）被視為共生信號(hào)傳導(dǎo)過程起始。而百脈根結(jié)瘤因子受體NFR1[1]和NFR5[1，2]以及蒺藜苜蓿中相應(yīng)的蛋白LYK3[3，4]和NFP[5]是感知結(jié)瘤因子的重要節(jié)點(diǎn)。最終根瘤菌通過侵染線（Infection threads，ITs）進(jìn)入根部，并在植物體內(nèi)定植，發(fā)育形成根瘤[6]。功能性結(jié)瘤的形成需要兩個(gè)獨(dú)立但緊密協(xié)調(diào)的發(fā)育過程：細(xì)菌侵染和結(jié)瘤器官發(fā)生。

LjNFR1和LjNFR5都屬于LysM受體樣激酶，由三個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域組成，分別為胞外的LysM結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TM）和膜內(nèi)絲氨酸、蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。結(jié)瘤因子的主要結(jié)構(gòu)為脂質(zhì)幾丁質(zhì)寡糖，能夠被LysM識(shí)別。Radutoiu等[1]在百脈根中鑒定到nfr1和nfr5兩種突變體，在接種根瘤菌的條件下均不能響應(yīng)結(jié)瘤因子信號(hào)，侵染及結(jié)瘤發(fā)生嚴(yán)重受阻。Madsen等[7]研究表明，NFR1和NFR5可以形成受體復(fù)合物，并且NFR1磷酸化NFR5，從而使胞外的LysM結(jié)構(gòu)域與結(jié)瘤因子相結(jié)合，導(dǎo)致復(fù)合體的結(jié)構(gòu)變化，從而與下游蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，向下游傳遞共生信號(hào)。但目前其信號(hào)傳遞機(jī)制仍沒有得到完全闡明，因此，鑒定與LjNFR1互作的蛋白質(zhì)并揭示其共生信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分重要。

有學(xué)者利用傳統(tǒng)的酵母雙雜交技術(shù)將NFR1的膜內(nèi)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域作為誘餌，分別鑒定到NFR1的互作蛋白PUB1[8]、SYMREM[9]。但更多的可能與NFR1等受體激酶的互作對(duì)象來源于膜蛋白質(zhì)，這為L(zhǎng)jNFR1互作蛋白質(zhì)的篩選造成了明顯障礙。通過建立酵母泛素膜雙雜交系統(tǒng)，以百脈根共生受體激酶LjNFR1全長(zhǎng)作為誘餌蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選，得到一個(gè)生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的5NG4-like蛋白質(zhì)。本研究利用酵母以及煙草體內(nèi)異源系統(tǒng)驗(yàn)證了百脈根Lj5NG4蛋白質(zhì)與LjNFR1蛋白質(zhì)的互作，借助tYFP熒光蛋白質(zhì)信號(hào)的共聚焦顯微鏡觀察證實(shí)了5NG4在侵染前期根毛中強(qiáng)烈表達(dá)，而在后期根瘤內(nèi)部不表達(dá)。利用CRISPR-Cas9技術(shù)得到百脈根Lj5NG4基因敲除的純合穩(wěn)定突變體，研究其共生表型發(fā)現(xiàn)Lj5NG4更多的在侵染前期尤其是侵染線形成過程中發(fā)揮抑制作用，但對(duì)結(jié)瘤數(shù)沒有顯著影響。此外，鑒于Lj5NG4可能是生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)子，對(duì)Lj5NG4突變株進(jìn)行生長(zhǎng)素的體外施加試驗(yàn)，經(jīng)過生長(zhǎng)素處理后，突變株侵染線數(shù)目上升的表型被顯著減弱，而不受突變影響的結(jié)瘤表型受生長(zhǎng)素調(diào)控明顯增加，這表明生長(zhǎng)素正調(diào)控共生侵染和根瘤發(fā)育。本研究初步分析了Lj5NG4在百脈根中的共生表型，為共生信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的完善提供了新的思路。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與主要試劑

百脈根MG20野生型種子和煙草種子由實(shí)驗(yàn)室保存提供。根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens EHA105、GV3101，發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogenes LBA1334，根瘤菌Rhizobium MAFF303099、NZP2235，酵母菌株THY.AP4[MATa ura3leu2lexA：：lacZ：：trp1lexA：：HIS3lexA：：ADE2]由實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2 ?質(zhì)粒構(gòu)建

以百脈根根與根瘤RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模版，設(shè)計(jì)引物5NG4-F和5NG4-R，使用高保真酶Q5擴(kuò)增全長(zhǎng)5NG4的開放閱讀框序列。PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min。按常規(guī)方法克隆到pPR3-N-G、JW772載體上。所有構(gòu)建的載體均通過測(cè)序驗(yàn)證。

使用同上的模版，設(shè)計(jì)引物NFR1-F和NFR1-R，使用KOD擴(kuò)增全長(zhǎng)NFR1的開放閱讀框序列。PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min;98 ℃ 10 s，51 ℃ 20 s，68 ℃ 1 min，循環(huán)5次;98 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，68 ℃ 1 min，循環(huán)30次;68 ℃延伸10 min。按常規(guī)方法克隆到pBT3-SUC、JW771載體上。

以百脈根總基因組DNA為模版，在第一個(gè)密碼子ATG上游2.2 Kb擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)引物5NG4pro-F、5NG4pro-R，PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min。按常規(guī)方法克隆到pC1300-tYFP-NLS載體上。

1.3 ?酵母試驗(yàn)檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作

將質(zhì)粒pPR3-N-5NG4與pBT3-SUC-NFR1通過醋酸鋰法共轉(zhuǎn)化酵母菌株AP4，共轉(zhuǎn)菌株涂布于SD/-Trp-Leu平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。同時(shí)以pAI-Alg5、pCCW-Alg5共轉(zhuǎn)酵母作為正對(duì)照，pDL2-Alg5、pBT3-SUC-NFR1共轉(zhuǎn)酵母作為負(fù)對(duì)照，pAI-Alg5、pBT3-SUC-NFR1共轉(zhuǎn)酵母驗(yàn)證蛋白質(zhì)表達(dá)。挑選單克隆在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，調(diào)節(jié)OD600保持一致，稀釋成5個(gè)濃度梯度，于SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His-Ade+15 mmol/L 3-AT的選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行點(diǎn)菌，30 ℃培養(yǎng)3 d后觀察。

1.4 ?煙草葉片體內(nèi)驗(yàn)證蛋白質(zhì)互作

將質(zhì)粒JW772-5NG4與JW771-NFR1通過電轉(zhuǎn)化共轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌菌株GV3101，LB（Kan+，Rif+）平板置于30 ℃培養(yǎng)2 d。同時(shí)將JW771和JW772共轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌作為負(fù)對(duì)照，JW771-LPOR和JW772-PCYA共轉(zhuǎn)作為正對(duì)照，分別將空載與JW772-5NG4、JW771-NFR1共轉(zhuǎn)作為自激活驗(yàn)證。注射煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，黑暗處理48 h后涂抹底物，通過活體成像儀CCD收集記錄熒光信號(hào)。

1.5 ?農(nóng)桿菌介導(dǎo)的百脈根植物轉(zhuǎn)化

百脈根毛根轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法主要參考Lotus japonicus操作手冊(cè)。毛根轉(zhuǎn)化將萌發(fā)5 d的幼苗從下胚軸剪短，將攜帶目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA1334菌液侵染傷口約40 min，轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2～3 d轉(zhuǎn)光照培養(yǎng)2～3 d，然后移至HRE生根培養(yǎng)基，約2周后在體式熒光顯微鏡下鑒定陽性根，剪去無熒光的非陽性根，種植到蛭石珍珠巖混合基質(zhì)中，用于后續(xù)試驗(yàn)。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)化將萌發(fā)幼苗的莖剪成0.3～0.5 cm的小段，與根癌農(nóng)桿菌EHA105共培養(yǎng)暗處理7 d，轉(zhuǎn)入含有抗生素潮霉素的愈傷篩選培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)約5周，再轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)、芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基使莖伸長(zhǎng)，最后將芽切下移至生根培養(yǎng)基，直至根長(zhǎng)出，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的T0代植株。

1.6 ?外源施加生長(zhǎng)素處理

使用無氮營(yíng)養(yǎng)液配置濃度分別為10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L的NAA溶液，將萌發(fā)5 d的幼苗種植到蛭石珍珠巖混合基質(zhì)中，隔天澆灌定量的生長(zhǎng)素溶液，7 d后接種根瘤菌NZP2235-hemA：：LacZ，繼續(xù)澆灌含生長(zhǎng)素的無氮營(yíng)養(yǎng)液，進(jìn)行前期和后期共生表型統(tǒng)計(jì)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?Lj5NG4蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

以LjNFR1為誘餌篩選百脈根酵母膜雙雜文庫，得到auxin-induced 5NG4-like蛋白質(zhì)編碼基因（Lj0g3v0198499）。通過Blast進(jìn)行同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與含有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和2個(gè)DUF6功能結(jié)構(gòu)域的同家族蛋白質(zhì)相比，篩選得到的多個(gè)5NG4-like蛋白質(zhì)編碼序列只含有最多4個(gè)C端跨膜域和1個(gè)不完整的DUF6結(jié)構(gòu)域。根據(jù)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曹揚(yáng)榮老師課題組提供的百脈根基因組數(shù)據(jù)庫，最終得到全長(zhǎng)的基因和蛋白質(zhì)序列。對(duì)不同物種中5NG4進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)Lj5NG4屬于nodulin MtN21/EamA-like transporter蛋白家族（圖1a）。對(duì)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜域分析，確定存在10個(gè)跨膜域，N端在膜內(nèi)，與同源蛋白質(zhì)一致（圖1b）。

2.2 ?百脈根LjNFR1與Lj5NG4蛋白質(zhì)互作的異源體內(nèi)驗(yàn)證

利用酵母雙雜交技術(shù)，進(jìn)一步確定LjNFR1和Lj5NG4蛋白質(zhì)相互作用的存在。將試驗(yàn)組和對(duì)照組轉(zhuǎn)入酵母菌株THY.AP4，產(chǎn)生的陽性克隆分別在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His-Ade+15 mmol/L 3-AT平板上點(diǎn)菌。根據(jù)圖2a的結(jié)果，Lj5NG4蛋白質(zhì)在酵母中能夠與LjNFR1蛋白產(chǎn)生強(qiáng)烈的相互作用。

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