一種硒代蛋氨酸衍生物的合成表征與安全性評價(jià)

唐燦　樊慶濤　王文龍　劉俊奇　劉梁　趙玲　陳新

摘要 以L-硒代蛋氨酸、月桂酰氯和油酰氯為主要原料通過肖頓-鮑曼縮合和酯化反應(yīng)得到了N-酰基-L-硒代蛋氨酸衍生物，產(chǎn)物運(yùn)用核磁共振（NMR）技術(shù)（1H NMR，13C NMR）表征確認(rèn)。采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法研究了目標(biāo)化合物對人體正常肝細(xì)胞（HL-7702）和大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，合成的目標(biāo)化合物對人體正常肝細(xì)胞（HL-7702）和大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）細(xì)胞毒性較低，當(dāng)2種目標(biāo)化合物的濃度達(dá)1 920 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率均大于75%，證明合成的硒代蛋氨酸衍生物是一種低毒的硒代化合物，對于擴(kuò)大硒代蛋氨酸在油脂類食品和農(nóng)產(chǎn)品加工領(lǐng)域的應(yīng)用具有一定潛力。

關(guān)鍵詞 L-硒代蛋氨酸衍生物;合成;核磁共振表征;細(xì)胞存活率

中圖分類號 O621.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2020）13-0162-03

Abstract NacylLselenomethionine derivatives were synthesized by Schotten-Baumann condensation using Lselenomethionine， lauroyl chloride and oleoyl chloride as the main raw materials， and then esterified with methanol to obtain the NacylLselenomethionine methyl ester. The product was characterized and confirmed by nuclear magnetic resonance （NMR） technology （1H NMR， 13C NMR）.In addition， the cytotoxicity of the target compound on human normal liver cells （HL7702） and rat renal tubular epithelial cells （NRK52E） was studied by MTT colorimetry. The results showed that two synthesized target compounds were less cytotoxic to human normal liver cells （HL7702） and rat renal tubular epithelial cells （NRK52E）. When the concentration of two target compounds reached 1 920 μ mol/L， the cell survival rate was greater than 75%， which proved that the synthetic selenomethionine derivative is a lowtoxic selenomethine compound and has certain potential for expanding selenomethionine in the field of oily food and agricultural products processing.

Key words Lselenomethionine derivative;Synthesis;NMR characterization;Cell survival rate

硒是一種重要的生命必需元素。目前一些研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物和人體硒元素的攝取率與一些癌癥的死亡率呈負(fù)相關(guān)[1]。硒元素的缺乏還與我國一些常見的地方病如克山病和大骨節(jié)病密切相關(guān)，并且動(dòng)物體或人體長期處于缺硒狀態(tài)，會導(dǎo)致白內(nèi)障患病概率升高[2-3]。另外，在一些報(bào)道中，硒在人體內(nèi)還具有清除自由基、抗衰老和提高免疫力的功能[4-5]，并且還能預(yù)防心血管疾病等慢性疾病[6-8]。目前，對于人體或動(dòng)物體的補(bǔ)硒產(chǎn)品，以有機(jī)硒為主要應(yīng)用方式。有機(jī)硒生物相容性更好，利用率高且毒性小，而其中的硒代氨基酸類更容易被動(dòng)物體和人體吸收[9-10]。硒代氨基酸是自然界中硒以有機(jī)形式存在于動(dòng)植物中的一種化合物，是利用率最高的一種有機(jī)硒化物[11-12]，它廣泛存在于一些富硒產(chǎn)地的天然植物中，可以作為補(bǔ)硒氨基酸的重要來源。在恩施地區(qū)生長的一些植物種中，硒存在的主要形態(tài)為硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸[13]。這些富硒地區(qū)的植物可以為硒代蛋氨酸的應(yīng)用提供豐富的來源。然而，硒代蛋氨酸作為補(bǔ)硒氨基酸的應(yīng)用存在一些問題，由于氨基酸的脂溶性較差，所以無論在食品飼料還是在醫(yī)藥等應(yīng)用領(lǐng)域，都以水溶性氨基酸來添加應(yīng)用，限制了其在油脂基食品和藥物等方面的應(yīng)用，因此通過增加氨基酸脂溶性基團(tuán)，使其脂溶性增強(qiáng)，可以在保持其原有活性的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大其在油脂類食品醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等方面的應(yīng)用范圍。

該研究選取L-硒代蛋氨酸為原料，通過Schotten-Baumann縮合反應(yīng)[14-16]和甲酯化反應(yīng)[17]合成一種N-?；?L-硒代蛋氨酸甲酯衍生物，通過增加L-硒代蛋氨酸疏水基團(tuán)，改變硒代氨基酸的表面活性，增強(qiáng)其脂溶性，從而增加其對生物膜的通透性。通過對硒代蛋氨酸這種修飾，不僅可擴(kuò)大硒代蛋氨酸的應(yīng)用范圍，還能為富硒植物中硒代蛋氨酸的加工應(yīng)用提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-硒代蛋氨酸（湖北信康醫(yī)藥化工有限公司）;月桂酰氯（上海阿拉丁生化科技股份）;油酰氯（上海阿拉丁生化科技股份）;四氫呋喃（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;硫酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;含有10%胎牛血清DMEM（高糖）培養(yǎng)液（北京索萊寶科技有限公司）;人體正常肝細(xì)胞（HL-7702）、大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）[上海吉?jiǎng)P基因生物科技有限公司（10 000/孔），來源CTCC];MTT溶液（5 g/L，北京索萊寶科技有限公司）;其他試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

OHAUS STARTER 3100 pH計(jì)（奧豪斯儀器（上海）有限公司）;DF-101B集熱式磁力加熱攪拌器（常州市金壇友聯(lián)儀器研究所）;BUCHI R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦有限公司）;Bruker-500型核磁共振波譜儀（布魯克（北京）科技有限公司）;PerkinElmer EnSpire 多功能酶標(biāo)儀（珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司）。

1.3 合成方法

目標(biāo)化合物的合成路線如圖1所示，以6a的合成為例。取500 mg的L-硒代蛋氨酸溶于10 mL的KOH溶液中，將此溶液加入到100 mL的三頸燒瓶中置于冰浴條件下攪拌。量取月桂酰氯1.2 mL使其溶解于10 mL THF溶液并置于分液漏斗中。向三頸燒瓶中以5 s/滴的速度滴加月桂酰氯的THF溶液，并同時(shí)向其中緩慢滴加KOH溶液，使pH保持在9。滴加完畢后，置于25 ℃水浴條件下攪拌反應(yīng)2 h，隨后向其中滴加稀鹽酸溶液使pH達(dá)1～2。反應(yīng)完成后取出到分液漏斗中，加入乙酸乙酯30 mL萃取3次，合并有機(jī)相后，將萃取液用飽和食鹽水洗滌2次后減壓濃縮。蒸干后經(jīng)快速硅膠柱層析純化后得到5a N-月桂?；?L-硒代蛋氨酸白色固體386.2 mg，產(chǎn)率為77.24%。取500 mg N-月桂?；?L-硒代蛋氨酸于反應(yīng)燒瓶中，加入10 mL 5%的硫酸-甲醇溶液，振搖均勻后，在60 ℃加熱30 min，反應(yīng)完畢后，用正己烷萃取2次，取上層清液后減壓濃縮，過柱層析純化后得到6a N-月桂酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯白色固體374.2 mg，產(chǎn)率為74.84%。

1.4 N-?；?L-硒代蛋氨酸甲酯對人體正常肝細(xì)胞（HL-7702）和大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）的細(xì)胞毒性評價(jià)

采用噻唑藍(lán)（MTT）[18-19]比色法對合成的N-酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯的細(xì)胞毒性進(jìn)行測試。取對數(shù)生長期的人體正常肝細(xì)胞（HL-7702）和大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）懸浮于含10 %胎牛血清培養(yǎng)液的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基中，接種于96孔板中，每孔大約1×104個(gè)細(xì)胞，將96孔板放置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過24 h后取出，分別加入0、80、160、240、320、640、1 280、1 920 μmol/L濃度的合成目標(biāo)化合物，各組設(shè)平行重復(fù)的6孔進(jìn)行試驗(yàn)。在給藥后，將96孔板繼續(xù)置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后每孔加入10 μL MTT液（5 g/L）進(jìn)行染色，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL二甲亞砜（DMSO），搖勻后，用酶標(biāo)儀檢測每孔在490 nm處的吸光度值，按如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

運(yùn)用NMR核磁共振技術(shù)分別對產(chǎn)物進(jìn)行了1H NMR，13C NMR結(jié)構(gòu)確認(rèn)，化合物5a白色固體，產(chǎn)率為77.24%。1H NMR（400 MHz，Chloroform-d）δ 10.30（s，1H），6.67（d，J = 7.6 Hz，1H），4.66（td，J = 7.4，5.0 Hz，1H），2.52（t，J = 7.7 Hz，2H），2.27-2.20（m，2H），2.20-201（m，2H），1.95（s，3H），1.64-1.54（m，2H），1.35-1.14（m，16H），0.84（t，J = 6.8 Hz，3H）。13C NMR（101 MHz，cdcl3）δ 174.66，174.47，52.59，36.41，32.50，31.86，29.60，29.58，29.48，29.31，29.30，29.21，25.70，22.63，20.23，1407，4.11。

化合物5b黃色油狀液體，產(chǎn)率為68.77%。1H NMR（400 MHz，Chloroform-d）δ 9.78（s，1H），6.62（d，J = 4.4 Hz，1H），5.32（ddt，J = 15.9，5.7，2.9 Hz，2H），4.67（td，J = 7.4，5.0 Hz，1H），2.52（t，J = 7.7 Hz，2H），2.26- 2.22（m，2H），2.13-2.00（m，2H），1.98（d，J = 10.5 Hz，2H），1.96（s，3H），1.92（dd，J = 11.3，6.6 Hz，2H），1.65-1.53（m，2H），1.33-119（m，20H），0.89-0.80（t，3H）。13C NMR（101 MHz，cdcl3）δ 174.55，174.46，129.95，129.63，52.55，36.40，32.57，32.51，31.86，29.72，29.69，29.62，29.48，29.28，29.22，29.13，2719，27.15，25.67，22.64，20.21，14.08，4.12。

化合物6a白色固體，產(chǎn)率為74.84%。1H NMR（400 MHz，Chloroform-d）δ 6.26（d，J = 7.9 Hz，1H），4.68（td，J = 7.6，5.1 Hz，1H），3.71（s，3H），2.48（ddd，J = 8.5，6.6，3.2 Hz，2H），2.24-2.14（m，3H），2.06-1.98（m，1H），1.95（s，3H），1.63-1.55（m，2H），1.29-1.18（m，16H），0.83（t，J= 6.8 Hz，3H）。13CNMR（101 MHz，cdcl3）δ 173.10，172.56，5240，52.14，36.47，32.87，31.84，29.55，29.54，29.44，2929，29.27，29.20，25.57，22.61，20.24，14.05，4.15。

化合物6b黃色油狀液體，產(chǎn)率為68.71%。1H NMR（400 MHz，Chloroform-d）δ 6.29（d，J = 7.9 Hz，1H），5.42-5.20（m，2H），4.67（td，J = 7.6，5.1 Hz，1H），3.70（s，3H），2.54-2.41（m，2H），2.20-2.16（m，2H），2.04-1.96（m，2H），1.93（s，3H），1.90（dd，J = 10.0，5.2 Hz，2H），1.62-1.55（m，2H），1.23（d，J = 14.3 Hz，20H），0.86-0.80（t，3H）。13C NMR（101 MHz，cdcl3）δ 173.04，172.53，129.88，129.63，52.35，52.12，36.40，32.82，32.53，31.83，29.69，29.64，29.58，29.45，29.24，29.20，29.08，27.14，27.10，25.55，22.61，20.26，14.05，4.11。

2.2 目標(biāo)化合物細(xì)胞毒性結(jié)果

圖2和3分別為目標(biāo)化合物6a和6b在0、80、160、240、320、640、1 280、1 920 μmol/L濃度下對于HL-7702細(xì)胞和NRK-52E細(xì)胞存活率的影響，由圖可以看出，當(dāng)6a和6b濃度在0～1 920 μmol/L時(shí)對細(xì)胞存活率的影響不顯著。6a和6b對于HL-7702細(xì)胞和NRK-52E細(xì)胞存活率均具有濃度依賴性，隨著2種化合物濃度的升高，細(xì)胞存活率均下降。但在化合物濃度為1 920 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率均在75%以上，證明2種化合物的細(xì)胞毒性較小。

3 結(jié)論

（1）以L-硒代蛋氨酸、月桂酰氯和油酰氯為主要原料通過肖頓-鮑曼縮合合成了N-?；?L-硒代蛋氨酸，經(jīng)酯化反應(yīng)得到N-?；?L-硒代蛋氨酸甲酯，產(chǎn)物運(yùn)用核磁共振技術(shù)

（1H NMR，13C NMR）進(jìn)行表征確認(rèn)。

（2）對合成的目標(biāo)產(chǎn)物N-月桂?；?L-硒代蛋氨酸甲酯和N-油酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯進(jìn)行了細(xì)胞毒性評價(jià)，應(yīng)用MTT比色法研究了2種化合物對HL-7702和NRK-52E細(xì)胞存活率的影響。2種化合物隨著濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，但在1 920 μmol/L濃度時(shí)，總體細(xì)胞存活率都高于75%，表明N-月桂?；?L-硒代蛋氨酸甲酯和N-油酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯的細(xì)胞毒性均不顯著。

該試驗(yàn)合成的目標(biāo)化合物可以作為一種補(bǔ)充動(dòng)物或人體的硒元素潛在化合物，合成工藝簡便，目標(biāo)產(chǎn)物不具有細(xì)胞毒性。與以往的硒代氨基酸產(chǎn)品相比，目標(biāo)化合物具有較強(qiáng)的脂溶性，可應(yīng)用添加于一些食用油類或油脂類食品飼料中，擴(kuò)大了硒代蛋氨酸的應(yīng)用范圍，為富硒植物農(nóng)產(chǎn)品中硒代蛋氨酸的加工生產(chǎn)提供了一種新的思路。

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