周玉麗　王寧寧　張雪平

摘 要：黑果枸杞是我國西北地區(qū)重要的防沙固土和藥用藤本植物，離體培養(yǎng)技術(shù)是其快速繁殖幼苗的一種重要途徑。該文綜述了黑果枸杞離體培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展，并對其在實際生產(chǎn)中存在的問題進(jìn)行了探討。

關(guān)鍵詞：黑果枸杞;離體培養(yǎng);進(jìn)展;問題

中圖分類號 S567.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）12-0020-03

Abstract： In vitro Culture technology is an important way for rapid propagation of plant seedlings. Lycium ruthenicum is an important medicinal vine plant for sand control in Northwest China. In this paper， the main key technology of in vitro culture of Lycium ruthenicum was summarized， the research status of in vitro culture technology was analyzed， and the in vitro culture technology of Lycium ruthenicum and the problems in its practical production were discussed.

Key words： Lycium ruthenicum; In vitro Culture; Progress; Problems

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為枸杞屬（Lycium）小灌木，在我國主要分布在西北多地及西藏等地[1]。球形漿果、紫黑色，果實味甜多汁，富含蛋白質(zhì)、微量元素、維生素等[2]，食藥兼用[3]。黑果枸杞提取物具有降血脂[4]、降血糖[5]、抗氧化[6]、抗衰老[7]、抗變異及抗腫瘤[8]等生理作用，具有較高的開發(fā)價值和應(yīng)用前景。黑果枸杞具有抗旱、耐鹽堿、防風(fēng)、固沙和護水等生態(tài)功能[9]。因此，研究黑果枸杞具有較高的經(jīng)濟和生態(tài)價值。

植物離體培養(yǎng)技術(shù)能夠為育種、品種保存和大規(guī)模種苗生產(chǎn)帶來可觀的經(jīng)濟效益，具有廣闊的發(fā)展空間及潛能[10]，目前，在細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、培養(yǎng)細(xì)胞突變體和人工種子等方面也開始發(fā)揮重要作用[11-12]。筆者對黑果枸杞離體培養(yǎng)的外植體選擇及消毒、愈傷組織誘導(dǎo)、分化及不定芽增殖、生根等方面的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了歸納及整理，以期為黑果枸杞的離體培養(yǎng)研究提供參考。

1 黑果枸杞組培快繁培育的研究進(jìn)展

目前植物器官、組織及原生質(zhì)體等均能培養(yǎng)再生植株[13]。黑果枸杞的離體快繁或植株再生大多選用4個步驟：（1）愈傷組織的誘導(dǎo)，通常采用葉片或莖段誘導(dǎo);（2）叢生芽的分化，通過使用不同植物生長調(diào)節(jié)劑，對愈傷組織進(jìn)行分化調(diào)節(jié)，得到較好的叢生芽分化體系;（3）植株的擴繁，通過篩選培養(yǎng)條件，優(yōu)化出最佳增殖配方;（4）最后再進(jìn)行生根培養(yǎng)。也有部分利用無菌苗葉片直接誘導(dǎo)再生植株的相關(guān)研究[14]。目前能查閱到較早有關(guān)黑果枸杞離體培養(yǎng)的文獻(xiàn)是浩仁塔本的研究[15]，他以帶腋芽的嫩莖段作為材料，成功誘導(dǎo)出不定芽并生根移栽成活。

1.1 外植體的選擇及消毒 外植體的選擇在植物離體培養(yǎng)中至關(guān)重要。黑果枸杞離體培養(yǎng)的外植體大部分采用種子播種的無菌苗?，F(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)資料表明，黑果枸杞離體培養(yǎng)選擇種子[16-21]、帶芽莖段[15，22-24]作為外植體較為常見，但也有以葉片[14，25-26]作初代培養(yǎng)的初始材料。獲得無菌外植體是離體培養(yǎng)成功的前提，不同外植體所需消毒劑和消毒時間均不相同[27]。升汞是一種常用的消毒劑，相關(guān)研究表明黑果枸杞枝條一般選用0.1%升汞，對黑果枸杞嫩枝的消毒效果較好[28]，但通常會選取酒精進(jìn)行滅菌前輔助消毒，滅菌時間長短應(yīng)根據(jù)不同的外植體類型來確定。相關(guān)研究表明，升汞消毒時間在2.5～16min[22，28-29]，相差較大的原因可能與取材的季節(jié)相關(guān)，采樣時間對外植體消毒時間影響極大，為達(dá)到理想效果，夏秋消毒時間最長能達(dá)到16min[28]，春季相對短一些。種子作為外植體，選用1.5%～8%次氯酸鈉溶液[14，17-18，20-21]處理3～10min即可達(dá)到預(yù)期效果。

1.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 愈傷組織培養(yǎng)是植物離體培養(yǎng)常見的培養(yǎng)形式[30]。培養(yǎng)基的成分是植物組織能夠正常生長的關(guān)鍵因素，大多數(shù)都選用MS基本培養(yǎng)基[15，17，23]，也有在啟動培養(yǎng)時用1/2MS和B5培養(yǎng)基[31]。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度和比例對調(diào)控培養(yǎng)物的生長和形態(tài)影響最大[32]。常用于黑果枸杞愈傷誘導(dǎo)的植物生長調(diào)節(jié)劑有2，4-D、NAA和6-BA。楊寧等[17]研究其無菌苗葉片誘導(dǎo)愈傷時，未添加任何植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基亦可長出少量愈傷，但出愈率很低。李琳等[18]研究顯示，2，4-D能夠誘導(dǎo)黑果枸杞細(xì)胞脫分化，其激素比例為6-BA∶2，4-D=1∶2;曹君邁等[14]研究同樣證實了上述試驗結(jié)果，即添加0.4mg/L 2，4-D可以誘導(dǎo)葉片形成較好的愈傷組織;但也有研究顯示以無菌苗葉片為外植體，可通過添加6-BA和2，4-D（激素比例為5∶1）誘導(dǎo)出較好的愈傷組織，但該研究特別強調(diào)較高濃度的2，4-D極易引起愈傷褐化現(xiàn)象[17]。愈傷誘導(dǎo)與外植體材料及植物生長調(diào)節(jié)劑種類和配比等直接相關(guān)[33]，衰老的植株脫分化過程極其困難且容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。因此，在黑果枸杞外植體誘導(dǎo)愈傷時，建議采用幼嫩組織進(jìn)行誘導(dǎo)。馬彥軍等[31]以嫩莖為材料，發(fā)現(xiàn)NAA能夠取代2，4-D誘導(dǎo)黑果枸杞嫩莖脫分化形成愈傷組織，該研究中選用的激素為6-BA和NAA，激素比例為1∶1，出愈率顯著提高，達(dá)到85%。裴小鵬等[25]以青海、甘肅、西藏3地的黑果枸杞為材料，在誘導(dǎo)葉片愈傷時添加6-BA（0.5mg/L）及NAA（0.1mg/L），愈傷誘導(dǎo)率均為100%;黑果枸杞根、莖、葉15d即可誘導(dǎo)出愈傷組織且誘導(dǎo)率均高于98%;孫曉紅等[26]用添加6-BA（1.0mg/L）及NAA（0.2mg/L）的MS培養(yǎng)基100%誘導(dǎo)出了葉片愈傷獲得成功;喬永旭等[34]采用相同激素組合對黑果枸杞子葉、下胚軸和胚根等組織進(jìn)行誘導(dǎo)，且在激素比例達(dá)到6-BA∶NAA=2∶1時誘導(dǎo)率可達(dá)到100%。由此可知，適合黑果枸杞愈傷誘導(dǎo)的6-BA濃度在0.2～1.0mg/L[18，26，34-35]，隨著NAA濃度的增加，黑果枸杞愈傷組織的生長狀況越佳，但6-BA濃度過高（1.5～2mg/L）會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，愈傷組織的生長狀態(tài)與植株生長調(diào)節(jié)劑直接相關(guān)。

1.3 愈傷組織的分化及不定芽的增殖 在離體條件下，不同生長調(diào)節(jié)劑及濃度組合對愈傷組織分化的效果不盡相同[33]。馬彥軍等[31]研究表明6-BA濃度較低的條件下，細(xì)胞分化率可達(dá)到80%以上，最高可達(dá)92%。汪清銳等[19]同樣使用6-BA作為細(xì)胞分化激素，40d后可從愈傷組織中獲得不定芽;隨6-BA濃度的上升，不定芽發(fā)生率也增加，但6-BA濃度高于一定值時，不定芽會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象[35]。玻璃化現(xiàn)象的產(chǎn)生與細(xì)胞分裂素濃度有很大關(guān)系[36]，當(dāng)培養(yǎng)基中 6-BA濃度較小時（小于0.4mg/L），不定芽生長基本正常。由此可知，低濃度的6-BA有利于黑果枸杞愈傷組織分化出正常的再生植株。李小艷等[29]在討論初代誘導(dǎo)芽分化的影響時，對促進(jìn)細(xì)胞分裂激動素KT的作用進(jìn)行了討論，結(jié)果顯示當(dāng)以MS為基本培養(yǎng)基時，添加KT和IBA的組合可以使外植體更快啟動，不定芽相較于添加6-BA和IBA激素的組合更為細(xì)弱;但是6-BA與IBA組合的條件下，芽生長的啟動緩慢，長勢也較為平緩。因此，可根據(jù)不同要求選擇不同激素組合。陳海軍等[20]通過分析發(fā)現(xiàn)，過低或過高的激素濃度均會抑制愈傷組織分化，添加6-BA（0.3mg/L）和NAA（0.05mg/L）最適宜分化形成叢生芽，分化率達(dá)80%。喬永旭等[34]研究了不同濃度6-BA、NAA對黑果枸杞愈傷組織分化的影響，結(jié)果顯示培養(yǎng)35d后芽開始形成，隨著6-BA/NAA比值的降低，叢生芽誘導(dǎo)率出現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)6-BA和NAA濃度均為0.5mg/L時叢生芽發(fā)生時間最早，誘導(dǎo)芽的增殖系數(shù)最高。也有部分研究顯示不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑MS培養(yǎng)基繼代增殖黑枸杞效果較好，增殖系數(shù)達(dá)到8[29]，這與浩仁塔本[15]、李媛媛[28]、楊寧[17]等研究不定芽增殖結(jié)果不一致。而孫曉紅等[26]試驗結(jié)果表明，添加1.4mg/L的ZT可以誘導(dǎo)葉片愈傷分化，這與以上大多數(shù)研究者研究結(jié)果均不同。分析其原因，李小艷等[29]認(rèn)為在田間能通過扦插繁殖的材料，培養(yǎng)時對植物生長調(diào)節(jié)劑的需求量會較少或基本不需要，但大多數(shù)研究均顯示單獨添加6-BA，或6-BA與NAA、IBA組合有利于不定芽增殖。

1.4 生根培養(yǎng) 黑果枸杞組培苗生根常用的生長素為IBA[17，24-25]，但也有少數(shù)在生根培養(yǎng)基中混合添加IBA和NAA[19，26]或只添加IAA[37]誘導(dǎo)不定根。楊寧等[17]研究發(fā)現(xiàn)較低濃度IBA（0.2mg/L）生根率極高，可達(dá)到95%。李媛媛等[28]研究表明，當(dāng)IBA濃度為0.1～0.2mg/L時，1/2MS相較于MS培養(yǎng)基效果更佳。馬彥軍等[31]將NAA和IBA進(jìn)行組合得到了黑果枸杞組培苗較好的生根效果，這與汪清銳等[19]研究結(jié)果基本一致。裴小鵬等[25]研究表明添加0.2～0.3mg/L的IBA的1/2MS培養(yǎng)基適宜生根。由此可知，多數(shù)研究者認(rèn)為1/2MS培養(yǎng)基添加0.1～0.3mg/L的IBA生根效果較好。

2 問題與展望

近年來黑果枸杞野生資源遭到破壞性采挖[14]，其生存生態(tài)環(huán)境日趨惡化[[38]，人工栽培黑果枸杞勢在必行。雖然黑果枸杞扦插技術(shù)較為成熟[39]，但扦插繁殖周期較長[24]，因此，離體快繁是保護黑果枸杞野生資源的有效途徑之一。當(dāng)前黑果枸杞離體培養(yǎng)研究中的問題主要有培養(yǎng)繼代周期偏長、研究單一化等，今后可以離體培養(yǎng)為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代植物生物技術(shù)，開展黑果枸杞的植物生物技術(shù)育種，培育黑果枸杞新品種。

（上接21頁）

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（責(zé)編：徐世紅）