高穎

摘要 為研究載脂蛋白AI（apoAI）和載脂蛋白B（apoB）在脂肪肝中的調(diào)節(jié)作用，采用原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)來培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞。正常貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞分別用1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L的DL-乙硫氨酸處理，在24、48 h時(shí)測(cè)定對(duì)照組及處理組細(xì)胞裂解液中apoAI、apoB、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）的含量。結(jié)果表明，肝臟極低密度脂蛋白（VLDL）的合成限速關(guān)鍵物質(zhì)是apoB，而VLDL又對(duì)甘油三酯（TG）起主要輸出作用。apoB的降低可能是肝臟脂肪變性發(fā)展的重要因素，因此確立apoB作為脂肪性肝炎的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞 細(xì)胞培養(yǎng);脂肪肝;載脂蛋白;脂蛋白

Abstract In order to investigate regulating metabolism of apoAI，apoB on fatty liver， rat hepatocytes were cultured by the method of primary cultured hepatocytes in vitro culture. The normal adhered hepatocytes were treated with 1.0， 2.0， 3.0， 4.0， 5.0 mmol/L DLethionine and the concentration of apoAI， apoB， LDL， HDL in cell lysate for 24 and 48 hours between treating respectively were measured. The results showed that VLDL was a major terminal route of lipoprotein B in the liver， and composition of apoB was the compositive ratelimiting step in VLDL. The significant factor of liver fatty degeneration incriminated apoprotein B degrading， thus apoB was established as a preindex on nonalcoholic steatohepatitis.

Key words Hepatocyte culture;Fatty liver;Apoprotein;Lipoprotein

載脂蛋白、細(xì)胞膜脂蛋白受體、脂代謝酶是介入脂蛋白代謝過程的主要因素，這是一個(gè)復(fù)雜的相關(guān)聯(lián)的動(dòng)態(tài)過程。載脂蛋白是血漿脂蛋白的主要成分，而apoB參與低密度脂蛋白受體（LDLR）的識(shí)別，是構(gòu)成其的主要蛋白質(zhì)。LDL 通過apoB 與 LDLR 結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，抑制內(nèi)源性膽固醇的合成并降低 LDLR 數(shù)目，對(duì)膽固醇代謝起著自我反饋的作用[1-2]。因此，載脂蛋白對(duì)血漿脂蛋白的代謝效率起控制性作用。筆者通過體外培養(yǎng)肝細(xì)胞、添加藥物、生化指標(biāo)測(cè)定等方法來檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)載脂蛋白和脂蛋白的含量變化，分析載脂蛋白對(duì)調(diào)節(jié)脂蛋白、甘油三酯含量的作用，從新的角度展開載脂蛋白在體內(nèi)對(duì)脂代謝相互作用的研究，以期為藥物研發(fā)提供新的實(shí)驗(yàn)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

SD大鼠，雄性，100～150 g，清潔級(jí)，健康，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑。

根據(jù)參考文獻(xiàn)[3-5]配制預(yù)灌流液、細(xì)胞洗液，培養(yǎng)基，預(yù)熱至37 ℃，備用。載脂蛋白AI試劑盒、載脂蛋白B試劑盒、直接高密度脂蛋白試劑盒、直接低密度脂蛋白試劑盒，置于室溫下備用。

1.1.3 主要儀器。

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，為日本SANYO公司產(chǎn)品;超凈工作臺(tái)，為德國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡成像系統(tǒng)，為OLYMPUS公司產(chǎn)品;24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，為NUNC公司產(chǎn)品;A-6型半自動(dòng)生化分析儀，為北京松上技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。

取成年SD大鼠，速眠新麻醉，采用二步灌流法獲取肝細(xì)胞[6-10]。用200目尼龍網(wǎng)布過濾，收集濾液，以800 r/min離心3 min，去上清液，將肝細(xì)胞加入培養(yǎng)基中重新懸浮，用移液管吹打幾次，混勻，再次離心，重復(fù)2次。計(jì)數(shù)板染色，觀察細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞活力，24孔板鋪入細(xì)胞，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 DL-乙硫氨酸處理大鼠肝細(xì)胞。

待細(xì)胞附著貼壁培養(yǎng)24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。用1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L DL-乙硫氨酸處理貼壁生長(zhǎng)良好的肝細(xì)胞，分為對(duì)照組（A）和處理組（B、C、D、E、F），每組6個(gè)重復(fù)，24 h換液1次。將細(xì)胞與裂解液一并轉(zhuǎn)入離心管，混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)。

1.2.3 生化指標(biāo)測(cè)定。

按照試劑盒說明書，利用生化分析儀分別測(cè)定A、B、C、D、E、F組24和48 h細(xì)胞裂解液中apoAI、apoB、LDL、HDL的含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

采用單因子方差分析（One-way ANOVA），0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 DL-乙硫氨酸對(duì)apoAI和apoB含量的影響

肝細(xì)胞中測(cè)定的生化指標(biāo)結(jié)果表明，DL-乙硫氨酸作用24 h時(shí)，處理組各組apoAI含量與對(duì)照組差異極顯著（0<P<0.01）;處理組B、C、D、E組apoB含量與對(duì)照組差異極顯著（0<P<0.01），F(xiàn)組與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。作用48 h時(shí)，處理組各組與對(duì)照組apoAI、apoB含量差異極顯著（0<P<0.01）（表1）。

2.2 DL-乙硫氨酸對(duì)LDL和HDL含量的影響

肝細(xì)胞中測(cè)定的生化指標(biāo)結(jié)果表明，DL-乙硫氨酸作用24 h時(shí)，處理組各組LDL含量與對(duì)照組差異極顯著（0

3 討論

肝細(xì)胞分解代謝脂蛋白與細(xì)胞膜上的脂蛋白受體結(jié)合物受載脂蛋白的影響。血液不能直接轉(zhuǎn)運(yùn)疏水性物質(zhì)，其也不能直接進(jìn)入組織細(xì)胞中，因此甘油三酯和膽固醇都必須與血液中的特殊蛋白質(zhì)和極性類脂合成脂蛋白，以便在血液中運(yùn)輸并進(jìn)入肝細(xì)胞。肝內(nèi)的脂蛋白被VLDL運(yùn)到肝外組織去貯存和利用。

該試驗(yàn)中apoAI和apoB含量的變化趨勢(shì)，分別與HDL、LDL的變化相關(guān)。肝臟內(nèi)蛋白質(zhì)的合成障礙減少了負(fù)責(zé)將TG轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟的載脂蛋白B的復(fù)合物，從而使VLDL轉(zhuǎn)運(yùn)不出去，TG含量升高，DL-乙硫氨酸代替甲基而提供乙基就是利用了這一點(diǎn)。apoAI和HDL的含量隨著DL-乙硫氨酸濃度的增加而升高。HDL的合成場(chǎng)所主要在肝臟內(nèi)，當(dāng)乳糜微粒（CM）和VLDL中的甘油三酯水解時(shí)，apoAI脫離其表面形成HDL。apoA是運(yùn)輸HDL的主要載脂蛋白，這證實(shí)了apoAI的含量越高，形成的HDL也越多。apoB控制著VLDL的轉(zhuǎn)運(yùn)，當(dāng)apoB含量下降時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)的VLDL含量增加，TG含量也升高。

載脂蛋白B的相關(guān)性研究用于心血管疾病、脂蛋白血癥、肥胖和膽囊疾病的臨床應(yīng)用更加實(shí)用化，為患者提供早期預(yù)測(cè)、實(shí)施正確的治療方案和進(jìn)行治療效果的評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 袁立英，趙瑾，羅德紅，等.腎臟疾病中載脂蛋白A1、載脂蛋白B測(cè)定及其臨床意義[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師，2017，33（27）：124-125.

[2] 楊開燕，鐘栩，盧玉俊，等.血漿載脂蛋白的研究進(jìn)展[J].臨床薈萃，2012（14）：1268-1271.

[3] 徐叔云，卞如濂，陳修，等.實(shí)驗(yàn)藥理方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：5812-5841.

[4] SEGLEN P O.Isolation of hepatocytes by collagenase perfusion[J].In vitro biological systems，1993，1：231-243.

[5] PICHARD L， RAULET E， FABRE G， et al.Human hepatocyte culture[J].Methods in molecular biology， 2006，320：283-293.

[6] MAKABEL B， ZHAO Y Y，WANG B， et al.Stability and structure studies on alisol a 24-acetate[J].Chem Pharm Bull， 2008，56（1）：41-45.

[7] 周星輝，王丙力，譚煥然.大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)模型的研究及其功能鑒定[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10（7）：743-746.

[8] 徐哲，白雪帆，滕光菊，等.大鼠肝細(xì)胞分離、原代培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2003，16（5）：342-344，351.

[9] NAKAGIRI R，ODA H，KAMIYA T.Small scale rat hepatocyte primary culture with application for screening hepatoprotective substances[J].Biosic Biotechnol Biochem，2003，67（8）：1629-1635.

[10] 徐旭，席文恭，于冰，等.乙硫氨酸對(duì)小鼠脂肪代謝影響的研究[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2009，26（5）：5-6.