徐浩文 馬銘 黃玲

摘要 [目的]分析我國(guó)8個(gè)沿海潮間帶紅條毛膚石鱉地理種群的COI基因的遺傳多樣性。[方法]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增8個(gè)地區(qū)80個(gè)紅條毛膚石鱉樣品的COI基因。使用DNASP5.10.01、MEGA7.0等軟件對(duì)所得序列進(jìn)行分析，得到片段堿基含量、遺傳距離以及遺傳多樣性參數(shù)等數(shù)據(jù)，并通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的方式，結(jié)合遺傳多樣性數(shù)據(jù)分析結(jié)果。[結(jié)果]獲得的COI基因片段長(zhǎng)度為659 bp，COI基因位于線粒體編碼區(qū)中，平均A、T、C、G的堿基含量分別20.4%、41.7%、14.9%和23.0%，存在明顯的AT偏向，結(jié)合Acanthochitona crinita為外群系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果來(lái)看，中國(guó)沿海地區(qū)紅條毛膚石鱉種群分成2個(gè)明顯的聚群，將它們定義為北方群體和南方群體，遺傳距離為0.000 66～0.087 85。單倍型遺傳多樣性數(shù)據(jù)顯示，多樣性數(shù)值較高，但核苷酸多樣性較低。[結(jié)論]紅條毛膚石鱉北方群體的遺傳多樣性與南方群體存在差異，2個(gè)群體應(yīng)該分別采取相應(yīng)措施來(lái)保護(hù)遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞 紅條毛膚石鱉;COI基因;遺傳多樣性

Abstract [Objective] To analyze the genetic diversity of COI gene in Acanthochiton rubrolineatus from 8 littoral geographical populations of China.[Method] COI gene of 80 samples of A.rubrolineatus from 8 geographical populations were amplified by polymerase chain reaction （PCR technology）.And we used DNASP5.1001，MEGA7.0 and other softwares to analyze the sequences，calculate the data of fragment base content，distance and other genetic diversity parameters，and analyze the results by the means of constructing phylogenetic trees in combination of genetic diversity data.[Result]The length of COI gene fragment was 659 bp，COI gene was located in the encoding region of mitochondria，and the average content of bases A，T，G，C was 20.4%，41.7%，14.9%，23.0% respectively，showing a significant AT bias.Combined with the results of phylogenetic trees with the outgroup of Acanthochitona crinite，we found that all haplotypes of A.rubrolineatus populations in China coasts were clustered into two apparent geographic lineages in phylogenetic trees，named as Northern group and Southern group，the genetic distance ranged from 0.000 66 to 0.087 85.The results of haplotype genetic diversity reflected that Hd was high，but the nucleotide diversity was low.[Conclusion]There were obvious differences between the northern group and southern group of A.rubrolineatus in China，and the northern and southern group should be protected separately by taking some measures.

Key words Acanthochiton rubrolineatus;COI gene;Genetic diversity

紅條毛膚石鱉（Acanthochiton rubrolineatus）隸屬軟體動(dòng)物門多板綱石鱉目毛膚石鱉科，生活在潮間帶中、低潮區(qū)巖石岸，主要分布在我國(guó)黃渤海到廣東沿岸，此外，日本也有分布[1]，是我國(guó)最常見(jiàn)的石鱉種群。石鱉屬于多板綱比較原始的軟體動(dòng)物，包含超過(guò)940種現(xiàn)生種以及430種石鱉化石標(biāo)本，在白堊紀(jì)至今漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷程中，其化石形態(tài)變化不大[2-3]，在研究軟體動(dòng)物的起源與進(jìn)化中有重要的地位和意義，紅條毛膚石鱉身體兩側(cè)對(duì)稱，長(zhǎng)橢圓形，背部中央凸出，并披有8塊石灰質(zhì)的殼板[4]，上面有3道暗紅色橫紋。相對(duì)于其他物種，石鱉物種沒(méi)有明顯的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，目前未見(jiàn)到人工養(yǎng)殖石鱉的相關(guān)報(bào)道，但具有重要的環(huán)境指示價(jià)值，是良好的水質(zhì)指示劑，對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要的作用。目前對(duì)紅條毛膚石鱉的研究主要集中在形態(tài)、齒舌新型磁性納米材料、食用藥用價(jià)值等方面[5-7]，而遺傳多樣性分析并不多見(jiàn)。遺傳多樣性是分析生物多樣性重要的手段，通過(guò)種群遺傳多樣性的分析可以揭示進(jìn)化歷史和種群進(jìn)化的可能性[8]，具有更高遺傳多樣性的物種或者種群能夠更好地適應(yīng)環(huán)境改變[9]，遺傳多樣性越高，或者變異越強(qiáng)的物種，其生存能力往往越強(qiáng)。探究紅條毛膚石鱉遺傳多樣性對(duì)于了解石鱉乃至軟體動(dòng)物進(jìn)化歷程，對(duì)維持生物多樣性具有重要的意義，同時(shí)遺傳多樣性的研究也可以對(duì)野生物種資源的保護(hù)和資源的可持續(xù)利用提供文獻(xiàn)參考。

分子標(biāo)記是以基因突變?yōu)榛A(chǔ)來(lái)分析物種遺傳與變異的方法，常見(jiàn)的分子標(biāo)記有RNA核糖體（16S rRNA、28S rRNA）[10]、細(xì)胞色素B（cytochrome b，Cytb）[11]、細(xì)胞色素氧化酶亞基I（cytochrome oxidase subunit I，COI）等[12]，筆者用到的分子標(biāo)記是位于線粒體DNA中的COI基因。線粒體DNA是探究動(dòng)物群體遺傳學(xué)常用的分子標(biāo)記，常用來(lái)進(jìn)行群體遺傳學(xué)的分析[13]，線粒體DNA不包含內(nèi)含子、間隔區(qū)和重復(fù)序列，母系遺傳，具有較高的序列替換速率[14]。COI基因是線粒體編碼蛋白最大的一個(gè)編碼區(qū)，變化速率快，相對(duì)于線粒體rRNA基因更加保守，被廣泛應(yīng)用在生物類群的種質(zhì)鑒定和低階分類階元的系統(tǒng)學(xué)研究中[15-16]，在海洋動(dòng)物遺傳群體的研究中應(yīng)用較為廣泛[17-18]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 樣品采集自我國(guó)沿海8個(gè)地區(qū)，包括大連（DL）、煙臺(tái)（YT）、威海（WH）、青島（QD）、連云港（LYG）、舟山（ZS）、玉環(huán)（YH）和廈門（XM）。采樣的地點(diǎn)多為海岸潮間帶礁石灘，采樣時(shí)間選擇退大潮時(shí)，具體采樣方法參考張楓軒[19]的方法。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取。取紅條毛膚石鱉腹部肌肉組織，每次取綠豆粒大小的肌肉組織，將組織在1.5 mL離心管中充分剪碎，用天根海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Marine Animals DNA Kit，DP324-03）提取總DNA?？侱NA使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA檢測(cè)，膠圖中出現(xiàn)清晰明亮條帶，說(shuō)明提取的DNA片段質(zhì)量較高，可以進(jìn)行后續(xù)的擴(kuò)增操作，隨后按照編號(hào)將結(jié)果較好的DNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增。通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找石鱉COI序列，并通過(guò)Primer5.0軟件遵循引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，得到正向反向引物序列分別為5′-GGTCAACAATCATAAAGATATTGG-3′、5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC-3′，由上海生工生物公司合成，將引物稀釋后按照22 μL水，25 μL Taq酶（TaKaRa TaqTM Version 2.0），1 μL DNA，上下游引物各1 μL的比例配成50 μL的反應(yīng)體系，具體PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min后，溫度降至室溫，10 ℃下保存。

1.2.3 序列處理和分析。PCR所得產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)合格后送往上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得測(cè)序產(chǎn)物用DNAstar軟件中的Seqman軟件進(jìn)行剪切與拼接，使用MEGA7.0軟件對(duì)拼接序列進(jìn)行比對(duì)，所有序列均在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源檢測(cè)，確定為目的紅條毛膚石鱉的DNA序列;利用MEGA7.0對(duì)序列按地區(qū)進(jìn)行分組整合，計(jì)算各組之間的遺傳距離、各組之間堿基組成以及以Acanthochitona crinita為外群構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，利用DNASP5.10.01軟件對(duì)序列進(jìn)行遺傳多樣性數(shù)據(jù)的收集分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果 PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，表明目的基因的擴(kuò)增效果較好。

2.2 堿基含量分析 獲得的COI基因片段裁切整齊對(duì)比后長(zhǎng)度為659 bp，作為下一步分析使用，通過(guò)MEGA7.0分析得到堿基組成結(jié)果（表1）。由表1可知，紅條毛膚石鱉的COI基因堿基片段各地區(qū)堿基組成差異不明顯，堿基A、T、C、G的平均含量分別為20.4%、41.7%、14.9%和23.0%，存在明顯的AT偏向，是一種比較普遍的堿基偏向性，其他生物的研究中也報(bào)道過(guò)這種堿基偏向[20-21]。

2.3 各地區(qū)遺傳距離分析 通過(guò)MEGA7.0軟件計(jì)算各地理種群間遺傳距離，所得結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，各地理種群間遺傳距離為0.000 66～0.087 85，遺傳距離差距較大。北方地理種群遺傳距離為0.002 96～0.016 10，南方地理種群的遺傳距離為0.000 66～0.087 85，南北方地理種群間遺傳距離較大，說(shuō)明南北方地理種群間存在較大的分化差異，南方地理種群的分化程度更大。

2.4 紅條毛膚石鱉COI基因遺傳多樣性分析 通過(guò)DNASP軟件對(duì)紅條毛膚石鱉種群進(jìn)行遺傳多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，COI基因片段的變異位點(diǎn)（S）為8～24個(gè)，單倍型多樣性（Hd）為0.844～1.000，核苷酸多樣性（π）為0.004 07～0.012 75，各地區(qū)單倍型多樣性數(shù)值較高，但核苷酸多樣性指數(shù)較低，該結(jié)果與王儒曉等[22]的研究結(jié)果相一致。Tajimas D 檢驗(yàn)[23]和Fus Fs檢驗(yàn)[24]常被用于評(píng)估種群的歷史動(dòng)態(tài)。Tajimas D和Fus Fs的檢驗(yàn)結(jié)果如果是負(fù)數(shù)，且脫離中性檢測(cè)比較明顯，說(shuō)明種群或許經(jīng)歷過(guò)群體的擴(kuò)張。從表3可以看出，南方種群的擴(kuò)張比較明顯，北方種群除威海可能由于遺傳漂變出現(xiàn)了正值，其他地區(qū)也都出現(xiàn)了不同程度的擴(kuò)張，其中，北方種群中青島的擴(kuò)張程度比較大，南方種群中玉環(huán)和廈門的擴(kuò)張程度較大，具體擴(kuò)張時(shí)間還需要借助其他手段進(jìn)行探討。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)常常被用來(lái)反映物種間的進(jìn)化關(guān)系，基于COI基因片段以Acanthochitona crinita為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，來(lái)自8地區(qū)80條序列共定義了26個(gè)單倍型，結(jié)果顯示以連云港為界限的北方與南方2個(gè)群體的單倍型分成2個(gè)明顯的進(jìn)化枝，紅色代表北方區(qū)域的單倍型集合，藍(lán)色代表南方區(qū)域的單倍型集合，2個(gè)集合之間存在明顯的遺傳差異，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果與遺傳距離結(jié)果相一致，說(shuō)明南北方地區(qū)紅條毛膚石鱉存在較大的分化差異。

3 結(jié)論

紅條毛膚石鱉是石鱉中分布很狹隘的一個(gè)種群，由于其特殊的生活習(xí)性，人們往往容易將它忽略。這個(gè)物種具有較高的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和生態(tài)價(jià)值，但是由于近年來(lái)頻繁的人類活動(dòng)，海水污染嚴(yán)重以及生態(tài)環(huán)境被破壞等因素影響，紅條毛膚石鱉的野生種群數(shù)目正在急劇下降，為了阻止這種趨勢(shì)，對(duì)紅條毛膚石鱉進(jìn)行一個(gè)綜合的遺傳多樣性分析來(lái)尋求對(duì)策建立保護(hù)措施顯得尤為必要。筆者分析了來(lái)自我國(guó)8個(gè)地區(qū)紅條毛膚石鱉的遺傳多樣性，結(jié)果顯示出我國(guó)紅條毛膚石鱉存在明顯的南北方分化差距，在進(jìn)行生物多樣性保護(hù)時(shí)應(yīng)區(qū)分南方地區(qū)以及北方地區(qū)，分別采取對(duì)應(yīng)措施來(lái)保護(hù)野生的紅條毛膚石鱉種群。

參考文獻(xiàn)

[1] 張均龍，史振平，王承，等.基于殼板和齒舌形態(tài)對(duì)中國(guó)沿岸幾種常見(jiàn)多板綱軟體動(dòng)物的分類研究[J].海洋科學(xué)，2015，39（11）：96-107.

[2] SCHWABE E.A catalogue of Recent and fossil chitons （Mollusca：Polyplacophora）.Addenda[J].Novapex，2005，6（4）：89-105.

[3] PUCHALSKI S S，EERNISSE D J，JOHNSON C C.The effect of sampling bias on the fossil record of chitons （Mollusca，Polyplacophora）[J].American malacological bulletin，2008，25（1）：87-95.

[4] 於宏華，趙青松，徐鎮(zhèn)，等.紅條毛膚石鱉生殖周期的研究[J].寧波大學(xué)學(xué)報(bào)（理工版），2006，19（1）：35-39.

[5] 錢霞，劉維，趙見(jiàn)高.紅條毛膚石鱉齒舌牙齒內(nèi)的納米磁性礦物質(zhì)[J].科學(xué)通報(bào)，2002，47（1）：10-13.

[6] 陳道海，孫世春.9種石鱉殼板的形態(tài)研究 [J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，40（6）：53-60.

[7] 易磊.精編本草綱目[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2010.

[8] SOLTIS P S，SOLTIS D E.Genetic variation in endemic and widespread plant species [J].Aliso：A journal of systematic and evolutionary botany，1991，13（1）：215-223.

[9] REED D H，F(xiàn)RANKHAM R.Correlation between fitness and genetic diversity [J].Conservation biology，2003，17（1）：230-237.

[10] LYDEARD C，MULVEY M，DAVIS G M.Molecular systematics and evolution of reproductive traits of North American freshwater unionacean mussels （Mollusca：Bivalvia） as inferred from 16S rRNA gene sequences [J].Philosophical transactions：Biological sciences，1996，351（1347）：1593-1603.

[11] ROPIQUET A，HASSANIN A.Molecular evidence for the polyphyly of the genus Hemitragus （Mammalia，Bovidae） [J].Molecular phylogenetics & evolution，2005，36（1）：154-68.

[12] SPRINGER M S，DOUZERY E.Secondary structure and patterns of evolution among mammalian mitochondrial 12S rRNA molecules [J].Journal of molecular evolution，1996，43（4）：357-373.

[13] 申紹祎.基于線粒體DNA的長(zhǎng)江上游四種薄鰍屬魚(yú)類遺傳多樣性研究[D].重慶：西南大學(xué)，2018.

[14] ARANA M V，GALLO L A，VENDRAMIN G G，et al.High genetic variation in marginal fragmented populations at extreme climatic conditions of the Patagonian Cypress Austrocedrus chilensis [J].Molecular phylogenetics & evolution，2010，54（3）：941-949.

[15] 程漢良，夏德全，吳婷婷，等.6種簾蛤科貝類及4個(gè)地理種群文蛤線粒體COI基因片段序列分析[J].海洋學(xué)報(bào)：中文版，2007，29（5）：109-116.

[16] 鄭文娟，朱世華，沈錫權(quán)，等.基于線粒體COI基因序列探討泥蚶的遺傳分化[J].動(dòng)物學(xué)研究，2009，30（1）：17-23

[17] 諶微，張鳳英，王景，等.基于COI基因序列的東、黃海區(qū)野生與養(yǎng)殖大黃魚(yú)遺傳多樣性分析[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2016，23（6）：1255-1267.

[18] 吳曉雯，張華偉，余海，等.基于DNA條形碼對(duì)浙南島嶼日本花棘石鱉的遺傳特征分析[C]//浙江省第四屆動(dòng)物學(xué)博士與教授論壇、動(dòng)物學(xué)與經(jīng)濟(jì)強(qiáng)省-浙江省動(dòng)物學(xué)研究及發(fā)展戰(zhàn)略研討會(huì)論文摘要集.杭州：浙江省科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)，2017.

[19] 張楓軒.一些常見(jiàn)的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的采集方法[J].海洋科學(xué)，1984，8（6）：63.

[20] 陳夢(mèng)璇，于立強(qiáng)，靖美東.我國(guó)不同地區(qū)小鼠Y染色體Zfy1基因遺傳差異分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（8）：90-92.

[21] 李石磊，張明，王慶志，等.16種環(huán)節(jié)動(dòng)物線粒體基因排列、特征比較及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].水產(chǎn)科學(xué)，2015，34（2）：104-112.

[22] 王儒曉，李媛媛，劉傳林，等.環(huán)渤海紅條毛膚石鱉種群遺傳多樣性研究[J].四川動(dòng)物，2019，38（1）：20-27.

[23] TAJIMA F.Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism[J].Genetics，1989，123（3）：585-595.

[24] FU Y X.Statistical tests of neutrality of mutations against population growth，hitchhiking and background selection[J].Genetics，1997，147（2）：915-925.