李志偉 袁曼曼 齊曉紅

摘要 [目的]促進(jìn)體細(xì)胞克隆技術(shù)的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。[方法]以長白豬、杜洛克豬2個品種種豬不同個體的耳部成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞，體外構(gòu)建克隆胚胎，并對其克隆胚胎體內(nèi)外發(fā)育以及產(chǎn)仔情況進(jìn)行研究。[結(jié)果]長白豬、杜洛克2個品種種豬克隆胚胎分裂率、囊胚率分別為100%和 83.7%、31.3%和19.1%。將來源于2個品種不同個體供體細(xì)胞的共3 419枚體外構(gòu)建克隆胚胎移植給19頭代孕母豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16頭代孕母豬共產(chǎn)下64頭克隆仔豬;長白豬和杜洛克豬受孕率分別為83.3%和84.6%，平均窩產(chǎn)仔數(shù)分別為（1.7±2.87）和（2.0±2.3）頭，平均初生重分別為（0.92±0.35）和（1.18±0.39）kg，以上指標(biāo)2個品種間均差異不顯著。長白豬克隆效率為0.84%，顯著低于杜洛克豬（2.42%）。[結(jié)論]該研究比較了不同種豬品種克隆胚胎體內(nèi)外發(fā)育以及出生情況，證明來源于成年種豬的耳部組織成纖維細(xì)胞可以有效用于克隆種豬，但克隆效率存在品種差異。

關(guān)鍵詞 體細(xì)胞克隆;組織凍存;胚胎移植;克隆仔豬

Abstract [Objective] To promote the largescale industrial application of somatic cell cloning technology.[Method]The embryos were cloned by using the fibroblast cells from ear tissues of Landrace and Duroc as donor cells，and then their development in vitro and in vivo and farrowing situation were studied.[Result]The ear fibroblast cells from both breeds above had excellent cell viability，the average cleavage rate and average blastocyst rate of the cloned embryos reached 100% and 83.7%（P<0.05），and 31.3% and 19.1% （P>0.05），respectively.After that，3 419 cloned embryos were transferred to 19 surrogate sows，among which 16 surrogate sows were conceived and littered，and 64 piglets were born.The conception rate，average litter size，average birth weight，and cloning efficiency of Landrace and Duroc reached 83.3% and 84.6%，（1.7±2.87）and （2.0±2.3），（0.92±0.35） and（1.18±0.39） kg，0.84% and 2.42%，respectively.[Conclusion]This study indicated that fibroblast cells from ear tissues of adult pigs could be successfully used for pig cloning industry，although the cloning efficiency could be significantly different between porcine breeds.

Key words Somatic cell nuclear transfer;Tissue cryopreservation;Embryo transfer;Cloned piglets

體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）是指利用一定的設(shè)備和技術(shù)，人工將動物的體細(xì)胞核與已經(jīng)去除核遺傳物質(zhì)的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外融合，組成重構(gòu)胚并在體外人工環(huán)境條件下發(fā)育至一定階段后，人工轉(zhuǎn)移入代孕母體生殖道內(nèi)，繼續(xù)發(fā)育成新的動物個體，以生產(chǎn)出大量遺傳同質(zhì)后代的過程。SCNT技術(shù)的本質(zhì)是無性繁殖，又稱為克隆技術(shù)。2000年，克隆豬技術(shù)誕生，并成功獲得了體細(xì)胞克隆后代[1-2]，宣告了一個全新的生物技術(shù)時代的到來。自此，克隆豬技術(shù)在畜牧業(yè)[3]、生物醫(yī)學(xué)[4-6]、野生瀕危動物保護(hù)[7-8]等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，并具有較高的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。利用克隆技術(shù)可以快速、有效地?cái)U(kuò)繁優(yōu)質(zhì)種豬后代，稀釋種豬育種成本，有助于優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源保護(hù)，并縮短豬品種遺傳改良的進(jìn)程[9];此外，克隆技術(shù)還可以結(jié)合基因編輯技術(shù)、全基因組選育技術(shù)和試管豬技術(shù)等[10]，培育出基因編輯豬群體，為豬品種改良、人類疾病和異種器官移植等領(lǐng)域作出貢獻(xiàn)[11-15]。

南方醫(yī)科大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)以中國本土小型豬品系豬種為試驗(yàn)動物，利用SCNT技術(shù)獲得了3只具有皮膚特異性表達(dá)pDKK1（pig Dickkopfrelated protein 1）基因的DKK1（Dickkopfrelated protein 1）轉(zhuǎn)基因克隆豬，研究結(jié)果為探索DKK1基因在豬皮膚生長、毛囊發(fā)育等方面的功能提供了豬模型[16]。Hwang等[17]利用SCNT技術(shù)成果獲取了1只健康的豬白細(xì)胞抗原（SLA）同型的體細(xì)胞克隆韓國本地豬種，且建立了相應(yīng)的克隆體系，克隆效率為0.65%～1.08%。Zhao等[18]以歐洲野豬為試驗(yàn)動物，首次研究了抗壞血酸對豬克隆胚胎去甲基化的作用機(jī)制，根據(jù)該研究結(jié)果，建議用于SCNT胚胎發(fā)育的培養(yǎng)基應(yīng)補(bǔ)充抗壞血酸。Jin等[19]通過不同的試驗(yàn)技術(shù)嘗試提高從供體細(xì)胞到受體的克隆過程不同階段豬的克隆效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該研究中使用的方法可能有助于提高豬的克隆效率。

體細(xì)胞核移植技術(shù)發(fā)展已有20多年，盡管越來越多的學(xué)者不斷地對該技術(shù)進(jìn)行探索，克隆技術(shù)也日臻完善，但哺乳動物克隆效率仍普遍較低。豬的克隆效率為0.5%～3.0%[20-21]。限制豬體細(xì)胞克隆效率的因素目前一般包括2個方面：一方面，豬卵母細(xì)胞含有大量的脂肪滴，對溫度等條件特別敏感;另一方面，豬是多胎動物，其妊娠的建立和維持至少需要4枚以上優(yōu)質(zhì)囊胚同時著床，需要移植大量的克隆胚胎才能保證產(chǎn)生足夠的妊娠識別信號[22]。同時，供體細(xì)胞類型的選擇和制備是提高克隆效率的關(guān)鍵步驟，經(jīng)過大量的試驗(yàn)，學(xué)者們對供體細(xì)胞的類型、供體來源、體外培養(yǎng)時間等方面進(jìn)行了大量試驗(yàn)[23-24]，通過比較豬胎兒成纖維細(xì)胞、成體成纖維細(xì)胞、成體前脂肪細(xì)胞和顆粒細(xì)胞等作為核移植供體細(xì)胞構(gòu)建重組胚胎的發(fā)育能力，結(jié)果表明成纖維細(xì)胞是作為核移植供體細(xì)胞最合適的細(xì)胞類型[25-27]。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，豬耳部成纖維細(xì)胞不僅具備完整的個體遺傳信息，而且具有優(yōu)異的細(xì)胞活性，取材后對供體動物的健康沒有任何影響。杜洛克豬是瘦肉型豬種之一，具有體質(zhì)結(jié)實(shí)、適應(yīng)性強(qiáng)、生長發(fā)育快、飼料利用率、肉質(zhì)較好等優(yōu)良特性，相較于其他品種，仔豬初生重較大;長白豬同樣作為瘦肉型豬種，具有飼料利用率高、瘦肉率高、母豬產(chǎn)仔多、泌乳性能好等優(yōu)點(diǎn)。該研究采集這2個品種種豬不同成年個體的耳部成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞，初步探討不同種豬品種對體細(xì)胞克隆技術(shù)效率的影響，旨在為進(jìn)一步提高種豬克隆效率并促進(jìn)該技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)室工作在河南創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室完成，養(yǎng)殖工作在漯河養(yǎng)殖場完成。

1.2 試劑

“方舟計(jì)劃”組織凍存套裝包括Stericome Solution 組織消毒液，F(xiàn)lushcome Solution 組織清洗液、Cryocome Solution 組織凍存液。

“方舟計(jì)劃”冷凍組織高效細(xì)胞分離建系試劑盒包括Digestcome Solution A 組織消化液A、Digestcome Solution B組織消化液B、Dissocome Solution P1.0細(xì)胞解離液P1.0、Pricome Solution P1.0 細(xì)胞培養(yǎng)液 P1.0、Cryoone Solution P1.0細(xì)胞凍存液 P1.0。

胚胎體外構(gòu)建及操作液體包括Washcome medium P1.0卵母細(xì)胞洗液、Matcome medium P1.0卵母細(xì)胞成熟液、Blacome medium P1.0胚胎培養(yǎng)液、Mancome medium P1.0卵母細(xì)胞顯微操作液、Fusioncome medium P1.0融合激活液、Transcome medium P1.0胚胎移植液。

以上試劑均為河南創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司提供的商品化試劑，其他試劑、藥品除特別注明外，均購自Sigma公司。

1.3 主要儀器與耗材

體式顯微鏡（Nikon）、超低溫冰箱（中科都菱）、顯微操作儀（Nikon）、電融合儀（ECM-2001）等;12孔培養(yǎng)板、4孔培養(yǎng)板、15 mL/50 mL離心管等細(xì)胞培養(yǎng)耗材均為Corning公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 卵母細(xì)胞收集和體外成熟。

豬卵巢采集于當(dāng)?shù)啬惩涝讏觯⌒迈r卵巢并立即置于盛有33～35 ℃生理鹽水的保溫瓶中，3 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，用10 mL注射器（12號針頭）抽吸直徑3～7 mm的卵泡。在顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞并于Washcome medium P1.0液中洗3次，然后在卵母細(xì)胞成熟液Matcome medium P1.0中洗2次并置于四孔培養(yǎng)板中，于38.5 ℃、5%CO2的CO2培養(yǎng)箱體外成熟42～45 h。顯微鏡下挑選成熟好的胞質(zhì)均勻且含有第一極體的卵母細(xì)胞備用。

1.4.2 供體細(xì)胞分離培養(yǎng)。

分別隨機(jī)選擇長白成年種公豬2頭、杜洛克成年種公豬3頭作為供體豬（所選種豬年齡均在2歲以內(nèi)），采集耳部組織，按照組織凍存試劑盒標(biāo)準(zhǔn)采樣流程進(jìn)行采樣后，4 ℃低溫條件下將樣本帶回實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)按照組織凍存試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行組織凍存，樣本存放在-80 ℃冰箱或液氮中。利用冷凍組織高效細(xì)胞分離建系試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)、細(xì)胞凍存或擴(kuò)增傳代以備克隆使用，待供體細(xì)胞達(dá)到80%匯合度后，接觸抑制1～2 d內(nèi)使用，且供體細(xì)胞一般使用1～3代以內(nèi)。

1.4.3 重構(gòu)胚構(gòu)建以及體外發(fā)育測試。

在顯微操作儀上，在Mancome medium P1.0顯微操作液中用固定針固定MⅡ期卵母細(xì)胞，用15～18 μm去核針吸取極體附近的胞質(zhì)，然后利用活細(xì)胞熒光染料Hochest33342進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下挑選成功去核的卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì);在顯微鏡下細(xì)胞大小均勻，折光性好、細(xì)胞表面光滑的供體細(xì)胞進(jìn)行透明帶下注射完成胚胎體外構(gòu)建。將構(gòu)建好的重構(gòu)胚置于融合液Fusioncome medium P1.0中，用電融合儀ECM2001進(jìn)行電融合、激活（場強(qiáng)為100 V/mm，3次脈沖，脈沖時間為30 μs）。然后，將融合、激活后的重構(gòu)胚轉(zhuǎn)移到添加細(xì)胞松弛素的Blacome medium P1.0胚胎培養(yǎng)液中，CO2培養(yǎng)箱（38.5 ℃、5% CO2）中培養(yǎng)3 h，此后再移入Blacome medium P1.0胚胎培養(yǎng)液，2、7 d時分別觀察胚胎分裂數(shù)、囊胚數(shù)并記錄。

1.4.4 克隆胚胎體內(nèi)移植以及克隆豬生產(chǎn)。

代孕母豬均為二元母豬，胎次不等，選擇的代孕母豬均有良好的繁殖記錄。利用2頭長白公豬個體供體細(xì)胞分別制作3頭份克隆胚胎，并隨機(jī)移植給6頭代孕母豬;隨機(jī)利用3頭杜洛克公豬個體供體細(xì)胞，分別制作3、5和5頭份克隆胚胎（每頭份克隆胚胎數(shù)量在150枚左右，胚齡約為0.5～2.0 d），隨機(jī)移植給10頭代孕母豬。選擇斷奶3～5 d的代孕母豬，并在代孕母豬發(fā)情高峰期開始后2 d內(nèi)進(jìn)行胚胎移植，手術(shù)前一天下午停喂飼料，手術(shù)當(dāng)天將構(gòu)建完成的優(yōu)質(zhì)克隆胚胎利用Transcome medium P1.0胚胎移植液于12 h內(nèi)帶入豬場。手術(shù)法將優(yōu)質(zhì)克隆胚胎從輸卵管傘部緩慢注入輸卵管。術(shù)后受體母豬單欄飼養(yǎng)，連續(xù)5 d注射抗生素防止炎癥發(fā)生，移植后密切觀察愈后情況。分別于胚胎移植后的21～28 d進(jìn)行第一次孕檢，49～56 d進(jìn)行第二次孕檢，大約114 d后記錄代孕豬分娩頭數(shù)和產(chǎn)仔情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

針對此次試驗(yàn)中不同種豬品種的克隆胚胎發(fā)育及產(chǎn)仔數(shù)據(jù)，利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分組間差異顯著性分析，分組間分裂率、囊胚率、妊娠率采用二項(xiàng)式檢驗(yàn)分析其差異性，分組間窩均產(chǎn)仔數(shù)、平均初生重采用獨(dú)立樣本t測驗(yàn)方法分析其差異性，各組間克隆效率采用卡方檢驗(yàn)分析其差異性，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬耳部成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)

按照組織凍存試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程，將長白豬、杜洛克豬耳部組織進(jìn)行組織凍存，并儲存于-80 ℃冰箱中，方便開展各種檢測。然后，利用冷凍組織高效分離試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程解凍冷凍組織，并進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)，結(jié)果顯示第3天開始有小三角形、梭形細(xì)胞爬出;第5～7天，梭形細(xì)胞優(yōu)勢生長，為典型的流水狀生長，細(xì)胞生長旺盛，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%以上時進(jìn)行傳代或細(xì)胞冷凍（圖1）。

2.2 克隆胚胎體內(nèi)外發(fā)育及出生情況

分別用長白豬、杜洛克豬2個品種不同個體的供體細(xì)胞構(gòu)建重構(gòu)胚，并比較其體內(nèi)外發(fā)育情況以及仔豬出生情況。由表1可知，長白豬與杜洛克豬克隆胚胎分裂率、囊胚率分別為100%和 83.7%、31.3%和19.1%，2個品種分裂率差異顯著（P<0.05），而2個品種間囊胚發(fā)育率差異不顯著（P>0.05）。分別將來源于長白豬和杜洛克豬不同個體的供體細(xì)胞體外構(gòu)建克隆胚胎（長白豬，1 189枚;杜洛克豬，2 230枚），然后分別移植到代孕母豬體內(nèi)（長白豬，6頭;杜洛克豬，13頭），其受胎率分別為83.3% 和84.6%，2個品種間差異不顯著（P>0.05）;平均窩產(chǎn)仔數(shù)和平均初生重分別為1.7和2.0頭、0.92和1.18 kg，這2個指標(biāo)在2個品種間均差異不顯著;其總克隆效率分別為0.84%和2.42%，差異顯著（P<0.05）（表2）。胚胎體內(nèi)外發(fā)育及克隆豬情況見圖2。

3 討論

體細(xì)胞克隆環(huán)節(jié)涉及供體細(xì)胞制備、卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)、重構(gòu)胚構(gòu)建及激活、重構(gòu)胚體外培養(yǎng)和胚胎移植等環(huán)節(jié)，每個技術(shù)環(huán)節(jié)都會影響克隆的效率。在這些環(huán)節(jié)中，供體細(xì)胞的制備、卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)和重構(gòu)胚構(gòu)建尤為重要。供體細(xì)胞的類型多種多樣，并且有多種類型的體細(xì)胞被證實(shí)具有完全的克隆發(fā)育能力，并作為供核細(xì)胞，成功得到了克隆后代[28-29]。但目前使用最廣泛的是胎兒成纖維細(xì)胞和新生豬耳組織成纖維細(xì)胞，這是由于其增殖能力強(qiáng)，易于轉(zhuǎn)染，且形成的重構(gòu)胚發(fā)育率較高，尤其是皮膚成纖維組織，取材方便，試驗(yàn)成本低。雖然有研究表明，豬胎兒成纖維細(xì)胞的生長速度快于皮膚成纖維細(xì)胞，也就是說其生長活力優(yōu)于皮膚成纖維細(xì)胞，且分化程度較低，便于進(jìn)行基本修飾等操作，更適合作為供核細(xì)胞[30-31]，甚至有研究表明胎兒成纖維細(xì)胞的克隆效率略高于皮膚成纖維細(xì)胞[24]，但制備豬胎兒成纖維細(xì)胞會受到試驗(yàn)成本及動物福利等因素的影響，因此根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期的研究成果，該試驗(yàn)選取耳部成纖維細(xì)胞作為供核細(xì)胞。

馬紅[32]研究表明采用出生7 d以內(nèi)的仔豬耳尖組織培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，并以此作為供核細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重構(gòu)胚卵裂率為65.6%，囊胚率為17.8%。另外，也有研究學(xué)者利用成年豬耳部成纖維細(xì)胞作為供核細(xì)胞，最終重構(gòu)胚囊胚率達(dá)9.4%[33]。該研究中將冷凍的成年豬耳部組織解凍復(fù)蘇后，進(jìn)行細(xì)胞分離，成功獲得了原代成纖維細(xì)胞，且細(xì)胞生長旺盛且形態(tài)良好，以該細(xì)胞作為供體細(xì)胞，可以支持克隆胚胎完全的體外和體內(nèi)發(fā)育潛能。同時，組織冷凍法并不影響其活性，且為體細(xì)胞克隆提供了一定的技術(shù)保障。

該研究結(jié)果表明長白豬的卵裂率顯著高于杜洛克豬（P<0.05），而2個品種的囊胚率不存在顯著差異（P>0.05）。這有可能是因?yàn)槠贩N特性不同及試驗(yàn)所用樣本數(shù)量不同，但總體來說平均卵裂率和囊胚率較高，可進(jìn)行樣本數(shù)量擴(kuò)大試驗(yàn)。對比前人的研究結(jié)果，也說明該試驗(yàn)重構(gòu)胚的發(fā)育效率較高，試驗(yàn)系統(tǒng)較為穩(wěn)定，可以大批量制備重構(gòu)胚，以供下一步克隆所用。

將構(gòu)建完成的重構(gòu)胚移植給代孕母豬，整體受孕情況較好，整體克隆效率也較高（1.87%）。有研究學(xué)者對影響克隆效果的供體細(xì)胞類型和胚胎移植數(shù)目等因素進(jìn)行了研究[19，34-36]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植克隆胚胎的最優(yōu)數(shù)量為150～249個，受孕率為30%～90%，克隆效率為0.70%～1.62%;對比國內(nèi)外豬克隆效率，筆者所在實(shí)驗(yàn)室的受體母豬受孕率和克隆效率均相對較高，其中長白豬受孕率約83.3%，杜洛克豬受孕率約84.6%，且2個品種間受孕率不存在顯著差異（P>0.05）。雖然2個品種間的平均窩產(chǎn)仔數(shù)和仔豬初生重均不存在顯著差異（P>0.05），但杜洛克豬的平均窩產(chǎn)仔數(shù)和仔豬初生重均高于長白豬，且杜洛克豬的克隆效率顯著高于長白豬（P<0.05）。根據(jù)長白豬產(chǎn)仔數(shù)較多，杜洛克豬仔豬初生重較大的品種特點(diǎn)，該試驗(yàn)結(jié)果中杜洛克豬的仔豬初生重高于長白豬，可能是由品種差異所致，而長白豬平均窩產(chǎn)仔數(shù)少于杜洛克豬，可能是由于樣本數(shù)量不同或長白豬遺傳穩(wěn)定性較差所導(dǎo)致的，結(jié)果表明杜洛克豬遺傳特性較為穩(wěn)定，且生產(chǎn)性能表現(xiàn)良好，在避免高溫高濕環(huán)境下生長，可使具有快長基因的杜洛克豬發(fā)揮遺傳潛力[37]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，杜洛克豬較高的克隆效率可能是因?yàn)槠漭^好的品種特性及遺傳潛力所致。

4 結(jié)論

綜上所述，利用組織凍存技術(shù)以及冷凍組織細(xì)胞分離技術(shù)，分離成年種豬耳部成纖維細(xì)胞，體外構(gòu)建克隆胚胎可以支持體內(nèi)、外發(fā)育以及克隆動物出生，為推進(jìn)體細(xì)胞克隆技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用于種豬克隆奠定基礎(chǔ)。

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