楊 娟, 楊立志, 邱銘錳, 陳婕婷, 徐葉潔, 劉新銳, 江玉姬,

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福建 福州 350002)

活性氧自由基是體內(nèi)高活性分子，通過氧化作用損傷組織器官，引起機(jī)體脂代謝、蛋白質(zhì)代謝異常、DNA損傷，進(jìn)而導(dǎo)致心腦血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾??；抗氧化劑能阻止氧化反應(yīng)并清除自由基[1-2].因此，天然、無副作用的藥物成為當(dāng)今抗氧化性藥物研發(fā)的重點(diǎn)之一.

食用菌富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，具有高蛋白和低脂肪的特點(diǎn).近年來，研究表明食用菌具有一定的藥理活性，如抗氧化、抗腫瘤和消炎[3-4]等功效.我國菌類資源豐富，許多食用菌已實(shí)現(xiàn)工廠化栽培，如金針菇[5]、雙孢蘑菇[6]和杏鮑菇[7]等.但關(guān)于珍稀食用菌如硫磺菌和木蹄層孔菌的抗氧化研究較少[8-9]，且硫磺菌和木蹄層孔菌目前較難進(jìn)行人工栽培.本文結(jié)合模糊數(shù)學(xué)評(píng)價(jià)法對(duì)14株珍稀食用菌的抗氧化性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，旨在為珍稀食用菌的開發(fā)及加工利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：14株菌株由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供(表1).

1.2 主要試劑與設(shè)備

DPPH、乙醇、鄰苯三酚、Tris-HCl緩沖溶液、鹽酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、磷酸鹽緩沖溶液、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵均為分析純.

表1 供試菌株

紫外分光光度計(jì)(UV-2601)由北京瑞利分析儀器有限公司提供；冷凍干燥機(jī)(LGJ-18S)由河南兄弟儀器設(shè)備有限公司提供；離心機(jī)(DL-5-B)由廈門精藝興業(yè)科技有限公司提供.

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備 PDA固體培養(yǎng)基：1 000 mL水、200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂.PDB液體培養(yǎng)基：1000 mL水、200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖[10].

1.3.2 食用菌發(fā)酵液與菌絲體提取液的制備 取一小塊菌種轉(zhuǎn)接于試管斜面上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10 d，待長滿管后接4塊大小較一致的菌塊于100 mL PDB培養(yǎng)基中，置于25 ℃、160 r·min-1恒溫箱培養(yǎng)8 d，過濾后分別得到發(fā)酵液(備用)和菌絲體，用去離子水沖洗菌絲體3次，預(yù)凍24 h后置于冷凍干燥機(jī)干燥24 h.稱取0.1 g干燥的菌絲體，研磨,蒸餾水定容100 mL，超聲提取30 min，過濾后取上清液即菌絲體提取液，測定發(fā)酵液和菌絲體提取液的抗氧化性，每組重復(fù)3次，取平均值.

1.3.3 DHHP自由基清除率的測定 參照林佳萍等[11]的方法.取樣品1 mL，分別加0.1 mmol·L-1DPPH 1 mL充分混勻，避光靜置30 min，于517 nm測定光密度.1 mL DPPH溶液與1 mL樣品混合均勻，測定其光密度(D1)；1 mL DPPH溶液與1 mL 95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇混合均勻，測定其光密度(D2)；測定空白對(duì)照光密度(D0).DPPH自由基清除率計(jì)算公式表示如下：

DPPH自由基清除率/%=[1-(D1-D2)/D0]×100

(1)

式中,D1為樣品光密度,D2為樣品參比液光密度,D0為空白對(duì)照光密度.

1.3.4 羥基(OH·)自由基清除率的測定 H2O2與Fe2+在水楊酸溶液體系中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生OH·，同時(shí)水楊酸捕捉OH·生成有色物質(zhì)，在510 nm處達(dá)到最大光密度值[12].依次向試管中加入1 mL 5 mmol·L-1水楊酸溶液、1 mL 5 mmol·L-1FeSO4和1 mL樣品，最后加入1 mL 5 mmol·L-1H2O2，啟動(dòng)反應(yīng).室溫反應(yīng)30 min，測其光密度(D).空白液以蒸餾水代替樣品，其它試劑相同；樣品本底液以蒸餾水代替H2O2，其它試劑相同.羥基自由基清除率計(jì)算公式表示如下：

羥基自由基清除率/%=[D0-(D1-D2)]/D0×100

(2)

式中,D0為空白光密度,D1為樣品光密度,D2為樣品本底液光密度.

(3)

式中,D1表示不含有樣品的光密度，D2表示不含有樣品和鄰苯三酚的光密度，D3表示含有樣品的光密度，D4表示含有樣品、不含有鄰苯三酚的光密度.

1.3.6 食用菌還原力的測定 在試管中分別加入1 mL樣品、1 mL 0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.5)、1 mL 1%(體積分?jǐn)?shù))鐵氰化鉀，混合均勻，于50 ℃反應(yīng)20 min；迅速冷卻后加入1 mL 10%(體積分?jǐn)?shù))三氯乙酸，混合均勻，3 000 r·min-1下離心10 min，取1 mL上清液，加3 mL去離子水和0.4 mL 0.1%(體積分?jǐn)?shù)) FeCl3，混合均勻，靜置10 min.以蒸餾水為空白對(duì)照.700 nm下測光密度[14].

權(quán)重的確定：由于各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)食用菌抗氧化性的影響程度不同，因此可根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重值確定一個(gè)權(quán)重向量[15].權(quán)重集是各項(xiàng)指標(biāo)在總體抗氧化性中所占比重的集合，每一個(gè)抗氧化指標(biāo)對(duì)應(yīng)一個(gè)權(quán)重系數(shù)[16].并對(duì)所有指標(biāo)的抗氧化數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化分析，得到權(quán)重系數(shù)(X)={x1，x2，x3，xn}，0≤x≤1.∑xi=1，其中X因素是U中的一個(gè)模糊子集，X與U相互對(duì)應(yīng).

模糊關(guān)系綜合評(píng)價(jià)集：采用模糊秩加權(quán)平均法建立模糊數(shù)學(xué)綜合評(píng)價(jià)模型，將權(quán)重集x與模糊關(guān)系矩陣R相乘，得到模糊綜合評(píng)價(jià)模型，即B=x·R.

(4)

式中，k為待定系數(shù)(k=2).

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 采用Spss 19.0分析數(shù)據(jù)，采用Excel繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 食用菌發(fā)酵液與菌絲體提取液對(duì)DPPH自由基的清除率

DPPH自由基是具有單電子、穩(wěn)定、以氮為中心的順磁化合物，當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，DPPH自由基接受一個(gè)氫原子或電子，形成穩(wěn)定的DPPH-H化合物[17].由圖1可知，除木蹄層孔菌外，其它菌株發(fā)酵液對(duì)DPPH的清除率均高于菌絲體提取液，表明食用菌發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基具有較好的清除能力.其中13號(hào)硫磺菌(9+1)菌株、14號(hào)硫磺菌(9+2)菌株發(fā)酵液對(duì)DPPH的清除率較高，分別為96.6%和94.08%；12號(hào)朱紅密孔菌(上杭)菌株發(fā)酵液對(duì)DPPH的清除率次之，為88.33%.從圖1可知食用菌菌絲體的胞外浸出液和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有一定的抗氧化性[18].4個(gè)菌株發(fā)酵液對(duì)DPPH的清除率大小表現(xiàn)為13號(hào)硫磺菌(9+1)>14號(hào)硫磺菌(9+2)>12號(hào)朱紅密孔菌(上杭)>4號(hào)紅緣擬層孔菌(177)，與其它菌株相比，有極顯著差異(P<0.01)，說明食用菌發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基的清除率比菌絲體大.

2.2 食用菌發(fā)酵液與菌絲體提取液對(duì)OH·自由基的清除率

OH·是一種重要的活性氧化劑，其基團(tuán)非?；顫姡磻?yīng)活性極強(qiáng)，具有電子配對(duì)的傾向[19-20].由圖2可知，除了3號(hào)紅緣擬層孔菌(270)、9號(hào)朱紅密孔菌(78)菌株外，其它菌株發(fā)酵液對(duì)OH·自由基的清除率均高于菌絲體提取液.OH·自由基清除率較高的2株菌株為14號(hào)硫磺菌(9+2)和13號(hào)硫磺菌(9+1)，清除率分別達(dá)到99.13%和98.93%.與其它菌株相比，差異極顯著(P<0.01).

2.3 食用菌發(fā)酵液與菌絲體提取液對(duì)自由基的清除率

2.4 食用菌發(fā)酵液與菌絲體提取液的還原力

由圖4可知，12號(hào)朱紅密孔菌(上杭)、13號(hào)硫磺菌(9+1)菌株、14號(hào)硫磺菌(9+2)菌株發(fā)酵液的還原力均高于菌絲體，與其它菌株相比存在極顯著差異(P<0.01).12號(hào)朱紅密孔菌(上杭)、13號(hào)硫磺菌(9+1)、14號(hào)硫磺菌(9+2)發(fā)酵液的還原力分別為0.299、0.272、0.128.說明不同菌株之間發(fā)酵液產(chǎn)物存在差異性，同一菌種不同菌株可能因?yàn)樯L特性有所不同，胞內(nèi)外抗氧化活性物含量不同，導(dǎo)致抗氧化性有差異.

2.5 抗氧化性的綜合評(píng)價(jià)

采用秩權(quán)平均法研究14株菌株抗氧化性并進(jìn)行篩選(表2).由表2可知，各項(xiàng)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)X={0.33,0.3,0.32,0.05}.對(duì)其抗氧化性結(jié)果進(jìn)行歸一化處理得到模糊關(guān)系矩陣，以R1為例，確定其模糊綜合評(píng)價(jià)模型B1.以同樣方法得到其它菌株的模糊綜合評(píng)價(jià)模型.

表2 不同菌株抗氧化的模糊評(píng)價(jià)

(5)

(6)

={0.61,0.68,0.45,0.78}

從表3可知，食用菌發(fā)酵液的抗氧化性比菌絲體提取液強(qiáng)，其中4種菌的抗氧化性較強(qiáng)，抗氧化性表現(xiàn)為14號(hào)硫磺菌(9+2)>13號(hào)硫磺菌(9+1)>4號(hào)紅緣擬層孔菌(177)>12號(hào)朱紅密孔菌(上杭).菌株發(fā)酵液抗氧化活性大于菌絲體，可能是因?yàn)椴煌臧麅?nèi)和胞外產(chǎn)生的抗氧化物質(zhì)的種類和含量不同[23].

表3 菌株抗氧化活性的綜合評(píng)價(jià)及篩選

3 小結(jié)