王玉啟, 馮 翯, 姚秋娟, 范琳俐, 金 航, 黃 維

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心;3.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002)

圓齒野鴉椿(EuscaphiskonishiiHayata，又名福建野鴉椿)為省沽油科野鴉椿屬常綠小喬木[1]，是我國特有珍稀藥用觀賞樹種，也是福建省民間傳統(tǒng)藥材，其根或皮、花、葉、果都可作藥用，主治胃痛、寒疝、脫肛、月經(jīng)不調(diào)等[2-3].圓齒野鴉椿果皮中主要含有多酚[4]、三萜[5]、黃酮類[6]等物質(zhì)，具有抗炎鎮(zhèn)痛、保肝抗癌等作用[7-9].其中，多酚類化合物是一類廣泛分布的植物次生代謝產(chǎn)物，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、提高免疫力[10-12]等多種生物活性，開發(fā)前景良好.然而，目前有關(guān)圓齒野鴉椿中多酚的研究較少，其提取工藝尚未見報道.本文以超聲波法提取圓齒野鴉椿果皮總多酚(total polyphenols fromE.konishiipericarp, TPEP)，采用Box-behnken試驗對TPEP提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察了TPEP的體外抗炎活性，以期為圓齒野鴉椿的開發(fā)和利用提供參考.

1 材料

1.1 藥品與試劑

圓齒野鴉椿于2018年10月采自福建省邵武市天成巖，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)鄒雙全研究員鑒定為省沽油科野鴉椿屬圓齒野鴉椿.將果實曬干后分離果皮和種子，果皮粉碎成粉并過50目篩備用.

胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈雙抗和PBS溶液購自Hyclone公司，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)、內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、沒食子酸購于北京索萊寶生物科技有限公司，地塞米松購自上海生工生物工程股份有限公司，福林酚試劑購于麥克林試劑有限公司，前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，NO檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為分析純.

1.2 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma)，UV-2700紫外可見分光光度計(日本島津公司)，BS-210S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Millipore Synergy-UV超純水機(jī)(美國密理博公司)，101A-0數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱(上海陽興試驗儀器有限公司)，TGL-16C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠).

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞(購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% FBS、1%雙青鏈雙抗)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

2 方法

2.1 TPEP的提取

取圓齒野鴉椿果皮干粉3.0 g放于250 mL圓底燒瓶中，根據(jù)試驗設(shè)計方案，加入一定濃度的乙醇溶液，按照相應(yīng)的液料比，放入水浴鍋中，控制提取的溫度、超聲功率以及時間，獲得提取溶液.

2.2 Box-behnken試驗

根據(jù)前期單因素試驗，選擇乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù))40%、50%、60%，液料比20∶1、30∶1、40∶1，提取溫度40、50、60 ℃，超聲功率200、300、400 W，及提取時間60、90、120 min，進(jìn)行Box-behnken試驗，用Design-Expert V8.0.6軟件對結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項式擬合.

2.3 多酚含量測定

采用Folin-Ciocateau法[13]測定總多酚的含量.取100 mg經(jīng)105 ℃干燥處理后的沒食子酸，用無水乙醇溫?zé)崛芙獾?00 mL的燒杯里，待溶液溫度至常溫后用無水乙醇定容至100 mL.分別量取沒食子酸溶液1、2、3、4和5 mL置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇配制10、20、30、40和50 mg·L-1沒食子酸工作液.分別取1 mL工作液至10 mL刻度試管中，加入5 mL福林酚試劑反應(yīng)10 min，再加入4 mL 2% Na2CO3溶液搖勻，在室溫環(huán)境下靜置1 h，然后在波長760 nm處測定溶液的光密度(D760 nm).獲得對照品濃度與光密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.012 6x+0.019 2(R2=0.999 3)，x為沒食子酸對照品的濃度(mg·mL-1)，y為D760 nm.

2.4 TPEP的制備

取圓齒野鴉椿果皮10 kg，用60%乙醇提取，將乙醇提取物濃縮后上樣到大孔吸附樹脂ASD7.先用蒸餾水去除多余的蛋白、色素等雜質(zhì)，再以30%～70%的乙醇洗脫樣品，薄層色譜(thin layer chromatography, TLC)檢測以1%三氯化鐵乙醇溶液/1%鐵氰化鉀水溶液(1∶1)呈藍(lán)紫色為標(biāo)準(zhǔn)，收集含多酚的組分，濃縮后得到TPEP.

2.5 TPEP抗炎活性測定

取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞密度為 2×105個·mL-1的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7接種于96孔板內(nèi)，每孔加入180 μL，將其放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜.設(shè)置空白組、模型組(LPS濃度為1 μg·mL-1)、試驗組(加入LPS和不同劑量的TPEP)和陽性對照組(200 μg·mL-1地塞米松)，每種處理在96孔板內(nèi)設(shè)5個復(fù)孔.試驗組按25、50、100、200 μg·mL-1的TPEP給藥，給藥2 h后模型組和試驗組每孔加20 μL相應(yīng)濃度的LPS，對照組每孔加20 μL的含血清培養(yǎng)基，22 h后分別用PGE2、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒和NO試劑盒檢測上清液中細(xì)胞所分泌的炎性因子的濃度.

2.6 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.采用Duncan′s多重比較法檢測各組數(shù)據(jù)間的差異顯著性，當(dāng)P<0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

3 結(jié)果與分析

3.1 Box-behnken試驗

3.1.1 回歸模型擬合 在單因素考察的基礎(chǔ)上，結(jié)合中心組合設(shè)計原理，選取乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)、超聲功率(D)和提取時間(E)5個因素作為自變量，以TPEP提取量(Y)作為因變量，設(shè)計5個因素3個水平的響應(yīng)面試驗(表1)，設(shè)計方案及結(jié)果見表2.

表1 Box-behnken試驗設(shè)計因素和水平

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert V8.0.6軟件采取響應(yīng)面法分析表2的數(shù)據(jù)，將TPEP的提取率作為響應(yīng)值，對各因素進(jìn)行線性模型擬合，得到多元二次回歸模型方程:Y=7.71-0.070×A-0.087×B+6.250E-003×C+0.056×D-1.000E-002×E+0.080×AB+0.022×AC-0.025×AD+0.027×AE+0.018×BC-7.500E-003×BD-0.017×BE+0.000×CD-0.010×CE-0.020×DE+0.35×A2+0.026×B2+4.792E-003×C2-0.024×D2+6.458E-003×E2(R2=0.942 6).通過二次模型及其回歸系數(shù)的方差分析檢驗該模型的可靠性，所得結(jié)果見表3.

該模型P<0.000 1，失擬項P=0.065 3>0.05，表明模型與實際擬合較好，可以用來預(yù)測TPEP提取率并分析優(yōu)化結(jié)果.由F值可得出，各因素對試驗結(jié)果的影響大小表現(xiàn)為液料比>乙醇濃度>超聲功率>提取時間>提取溫度.

表3 回歸模型方差分析1)

1)*為差異顯著(P<0.05)；**為差異極顯著(P<0.01).

3.1.2 響應(yīng)面工藝優(yōu)化分析 從5個因素交互作用響應(yīng)面(圖1～2)的陡峭情況可以看出，AB、AC、AD和AE的相互作用對TPEP提取率均具有較大影響.通過Design-Expert V8.0.6分析得出TPEP提取最佳工藝：乙醇濃度為43.73%，液料比為31.07∶1，提取溫度為52.72 ℃，超聲功率為298.46 W，提取時間為72.23 min.該條件下TPEP提取率達(dá)到8.32%.根據(jù)試驗條件調(diào)整，最終將乙醇濃度45%、提取溫度50 ℃、液料比31∶1、提取時間70 min和超聲功率300 W確定為最佳提取工藝.在進(jìn)行3次驗證試驗后，得到TPEP提取率平均值為(8.28±0.14)%，與理論值較為接近，且重復(fù)性好,表明應(yīng)用響應(yīng)面法得出的回歸模型較可靠.

3.2 TPEP的抗炎活性

以LPS作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7構(gòu)建體外炎癥的細(xì)胞模型.如表4所示，模型組在用1 μg·mL-1LPS作用細(xì)胞22 h后，RAW264.7細(xì)胞上清液中的NO、PGE2、IL-6和TNF-α分泌量較空白組顯著增加(P<0.01).將TPEP以DMSO溶解后用不含血清的培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度，分別對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞給藥，結(jié)果表明25、50、100和200 μg·mL-1TPEP呈現(xiàn)劑量依賴性地抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌炎性因子NO、PGE2、IL-6和TNF-α.同時，采用MTT法分析TPEP對細(xì)胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn)RAW264.7細(xì)胞的存活率均超過了90%，說明TPEP的抗炎活性與其細(xì)胞毒性無關(guān).

4 討論

響應(yīng)面法主要通過建立連續(xù)變量的多維曲面模型，擬合各因素與響應(yīng)值間的函數(shù)關(guān)系，評價各種影響生物過程的因子之間的交互作用，以確定各個因子最佳水平范圍，是一種較為高效的統(tǒng)計學(xué)方法[14].本試驗通過應(yīng)用響應(yīng)面法改進(jìn)TPEP的提取工藝，利用Box-behnken試驗進(jìn)行回歸模型擬合以及優(yōu)化分析，確定了最佳的提取工藝為提取時間70 min、液料比31∶1、提取溫度50 ℃、乙醇濃度45%和超聲功率300 W，在此提取條件下TPEP提取率為(8.28±0.14)%.

表4 TPEP對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌NO、TNF-α、PGE2和IL-6的影響1)

1)與空白組比較，##表示P<0.01；與模型組比較，*表示差異顯著(P<0.05)， **表示差異極顯著(P<0.01).

炎癥是機(jī)體對自身受到的各種損傷應(yīng)激所產(chǎn)生的一種防御現(xiàn)象，然而有研究發(fā)現(xiàn)過度的炎癥反應(yīng)常與心血管疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切關(guān)聯(lián)[15-16]，因此，抗炎類藥物開發(fā)是目前藥物研究的熱點之一.LPS具有極強(qiáng)的致炎性，能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞啟動炎癥反應(yīng)而引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)，因而常被用作炎癥模型的誘導(dǎo)劑[17-18].本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，圓齒野鴉椿果皮醇提物在抗炎方面有著不俗的表現(xiàn)[8]；本研究發(fā)現(xiàn)，TPEP能顯著抑制經(jīng)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7體外抗炎細(xì)胞的炎性因子NO、PGE2、IL-6和TNF-α的表達(dá)，顯示了良好的抗炎作用.但具體的抗炎機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.