吳 磊, 覃媛鈺, 譚光輝, 李杰章, 張依裕, 蔣會(huì)梅, 楊遠(yuǎn)清, 向程舉

(1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.畢節(jié)市畜禽遺傳資源管理站，貴州 畢節(jié) 551700)

IL-8屬于C-X-C亞家族，是一種非常重要的趨化因子，具有介導(dǎo)細(xì)胞在炎癥部位聚集、活化以及修復(fù)損傷的組織，刺激中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞發(fā)生趨化游走等功能[1-2].趨化因子是一種普遍存在的小分子量趨化蛋白，通過(guò)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞在感染期間遷移到感染部位進(jìn)而參與宿主防御[3].IL8R 屬于視紫紅質(zhì) G-蛋白偶聯(lián)受體超家族，有兩種類(lèi)型的基因，分別為IL8RA(只與IL-8有高度親和力)和IL8RB(能高度結(jié)合其他趨化因子)[4-5].研究表明，2種受體的氨基和羧基顯著不同，氨基的不同導(dǎo)致2種受體功能和作用有大的特異性[6].雞的白細(xì)胞介素8受體(interleukin-8 receptor bata, IL8RB)基因定位于7號(hào)染色體，全長(zhǎng)2 981 bp，由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成.IL8RB基因具有介導(dǎo)活化中性粒細(xì)胞的作用，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放貯存酶，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞筮功能，啟動(dòng)超氧離子釋放，導(dǎo)致機(jī)體局部發(fā)生炎癥反應(yīng)，達(dá)到殺滅病原菌的目的[7].Matsushima et al[8]檢測(cè)到IL8RB基因與許多實(shí)體腫瘤的耐藥性、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能影響家禽抗逆性.Luppi et al[9]證實(shí)IL8RB基因通過(guò)受體酪氨酸激酶磷酸化激活生長(zhǎng)因子信號(hào)反應(yīng)，能導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移的增強(qiáng).綜合前人研究結(jié)果可知，IL8RB基因是與某些疾病相關(guān)的基因，可能與家禽抗逆性有很大聯(lián)系，但關(guān)于畜禽IL8RB基因多態(tài)性的研究報(bào)道極為少見(jiàn).

本研究以貴州地方雞種長(zhǎng)順綠殼蛋雞、黔畫(huà)烏雞和威寧雞為研究對(duì)象，采用DNA直接單個(gè)測(cè)序篩選IL8RB基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)，計(jì)算其單倍型、雙倍型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性，探討IL8RB基因突變與黔畫(huà)烏雞肉品質(zhì)的聯(lián)系，旨在為今后進(jìn)一步研究該基因?qū)﹄u肉品質(zhì)及生理功能的影響提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

長(zhǎng)順綠殼蛋雞110只(♂38，♀72)、黔畫(huà)烏雞55只(♂15，♀40)和威寧雞76只(♂26，♀50)均隨機(jī)采自貴州大學(xué)家禽研究所科研雞場(chǎng).雞只均健康無(wú)病，通過(guò)翅靜脈采血和抗凝肝素鈉抗凝的方式采集血樣0.5～1.0 mL，按照DNeasy Blood & Tissue Kit(250)試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法逐只提取血樣基因組DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用NanoDrop 2000型核酸濃度檢測(cè)儀(美國(guó)NanoDrop公司)測(cè)定其濃度，并稀釋成終濃度為50～100 ng·μL-1，置-20 ℃保存?zhèn)溆?屠宰全部黔畫(huà)烏雞，取胸肌組織，參照李利等[10]的方法測(cè)定雞肉品質(zhì).

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank收錄的雞IL8RB基因序列(NC-006094.5)，采用網(wǎng)上引物設(shè)計(jì)軟件Primer3 Input (version 0.4.0)設(shè)計(jì)3對(duì)引物，引物信息見(jiàn)表1.F1/R1擴(kuò)增區(qū)域包括外顯子1、F2/R2和F3/R3擴(kuò)增區(qū)域包括外顯子2，引物由昆泰銳(武漢)生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成.

1.3 PCR擴(kuò)增

3對(duì)引物采用相同的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序.PCR反應(yīng)體系：1 μL基因組DNA模板、上游引物(10 μmol·L-1)和下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、10 μL 2×Es Taq MasterMix、7 μL雙蒸水，總體積為20 μL.PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min， 94 ℃變性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸6 min.待反應(yīng)結(jié)束后，把PCR反應(yīng)產(chǎn)物用移液槍加在1.5%瓊脂糖槽中進(jìn)行凝膠電泳，電泳儀電壓設(shè)置為135 V，電泳時(shí)間設(shè)定為30 min，電泳完成后立即放到凝膠成像儀上拍照，查看結(jié)果并截圖保存.選取特異性較好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往昆泰銳(武漢)生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序.

表1 IL8RB基因的引物序列

1.4 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

利用在線軟件RNAfold (http：//nibiru.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)對(duì)IL8RB基因突變前后編碼區(qū)序列mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用在線軟件SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)和分析IL8RB基因編碼區(qū)突變前后蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用在線軟件SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測(cè)IL8RB基因編碼區(qū)突變前后蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu).

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SHEsis網(wǎng)上在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/)計(jì)算SNP位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、單倍型頻率、基因型分布卡方值(χ2)、連鎖不平衡的D′和r2值.根據(jù)Nei et al[11]和Botstein et al[12]的報(bào)道計(jì)算觀察雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC).運(yùn)用SPSS 19.0軟件中的一般線性模型分析SNP位點(diǎn)基因型或雙倍型與所測(cè)定性狀指標(biāo)的相關(guān)性，模型為Y=μ+G+e(Y為性狀觀測(cè)值，G為基因型效應(yīng)或雙倍型效應(yīng)，μ為群體均值，e為隨機(jī)殘差).采用最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 IL8RB基因SNP的篩查與鑒定

對(duì)IL8RB基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果(圖1)表明，共發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP變異位點(diǎn)g.22589443 C>T和g.22589512 C>T，均處于IL8RB基因外顯子2的錯(cuò)義突變(3個(gè)雞種變異位點(diǎn)一致).g.22589443 C>T突變共產(chǎn)生3種基因型，引起亮氨酸變成絲氨酸；g.22589512 C>T突變共產(chǎn)生2種基因型，引起蘇氨酸變成甲硫氨酸.

2.2 IL8RB基因SNP位點(diǎn)的遺傳特性

對(duì)IL8RB基因在長(zhǎng)順綠殼蛋雞、黔畫(huà)烏雞和威寧雞鑒定到的3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行遺傳特性分析.結(jié)果(表2)顯示，3個(gè)雞品種g.22589443 C>T位點(diǎn)中的CC基因型和C等位基因分別為優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因，雜合度和有效等位基因數(shù)較高，多態(tài)信息含量屬于中度多態(tài)位點(diǎn)，長(zhǎng)順綠殼蛋雞g.22589443 C>T位點(diǎn)的基因型分布極顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)，而黔畫(huà)烏雞和威寧雞顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡(P<0.05).3個(gè)雞品種g.22589512 C>T位點(diǎn)中的CC基因型和C等位基因分別為優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因，雜合度和有效等位基因數(shù)較低，屬低度多態(tài)，基因型分布均未偏離平衡狀態(tài)(P>0.05).

表2 IL8RB基因SNP位點(diǎn)的群體遺傳特性1)

2.3 IL8RB基因SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡分析

對(duì)長(zhǎng)順綠殼蛋雞、黔畫(huà)烏雞和威寧雞IL8RB基因2個(gè)SNP位點(diǎn)g.22589443 C>T和g.22589512 C>T進(jìn)行連鎖不平衡分析.結(jié)果(表3)顯示，2個(gè)SNP位點(diǎn)的D′值均為1，r2值小于0.33，根據(jù)Ardlie et al[13]和Slatkin[14]的報(bào)道，當(dāng)|D′|>0.8和r2>0.33時(shí)認(rèn)為SNP位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡，揭示了本研究發(fā)現(xiàn)的2個(gè)SNP位點(diǎn)間不存在強(qiáng)連鎖不平衡.

表3 IL8RB基因SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡D′和r2值

2.4 IL8RB基因單倍型及雙倍型分析

對(duì)長(zhǎng)順綠殼蛋雞、黔畫(huà)烏雞和威寧雞IL8RB基因的2個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行單倍型和雙倍型分析.結(jié)果(表4)顯示，在檢測(cè)的3個(gè)雞群體IL8RB基因中，g.22589443 C>T和g.22589512 C>T位點(diǎn)共存在3種單倍型和4種雙倍型，單倍型H1(CC)和雙倍型H1H1(CCCC)出現(xiàn)的頻率最高，單倍型H3(CT)和雙倍型H2H2(TTCC)出現(xiàn)的頻率最低.

2.5 IL8RB基因生物信息學(xué)分析

就長(zhǎng)順綠殼蛋雞、黔畫(huà)烏雞和威寧雞IL8RB基因外顯子2上的g.22589443 C>T和g.22589512 C>T位點(diǎn)組合對(duì)mRNA序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行預(yù)測(cè).結(jié)果(圖2)顯示，CC組合mRNA序列結(jié)構(gòu)的自由能為-2 415.74 kJ·mol-1，TC組合的自由能為-2 412.81 kJ·mol-1，CT組合的自由能為-2 431.23 kJ·mol-1，穩(wěn)定性為：CT>CC>TC，TC與GenBank上收錄的序列相同，揭示突變使自由能降低，穩(wěn)定性升高.對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)SNP位點(diǎn)引起氨基酸變化但并未引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化.

2.6 IL8RB基因變異位點(diǎn)對(duì)黔畫(huà)烏雞常規(guī)肉質(zhì)指標(biāo)的影響

IL8RB基因變異位點(diǎn)g.22589443 C>T和g.22589512 C>T與黔畫(huà)烏雞肉品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果(表5)顯示， 2個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)黔畫(huà)烏雞肉品質(zhì)指標(biāo)的影響均不顯著(P>0.05),雙倍型H1H1(CCCC)個(gè)體的肉色指標(biāo)顯著高于H1H3(CCCT)個(gè)體(P<0.05)，其他雙倍型各指標(biāo)之間的差異均不顯著(P>0.05).

表4 IL8RB基因SNP位點(diǎn)的單倍型和雙倍型頻率

表5 IL8RB基因變異位點(diǎn)與黔畫(huà)烏雞常規(guī)肉質(zhì)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性1)

1)肉質(zhì)的各項(xiàng)指標(biāo)均在屠宰后40 min內(nèi)測(cè)定；同列數(shù)據(jù)后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者或無(wú)字母者表示差異不顯著(P>0.05).

3 討論

隨著人們生活水平的快速提高，對(duì)禽品質(zhì)的要求也越來(lái)越高，通過(guò)提高家禽抗逆性，培育出安全優(yōu)質(zhì)的禽產(chǎn)品，可以滿足人們對(duì)高品質(zhì)禽產(chǎn)品的需求[15].通過(guò)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)，IL8RB基因是與畜禽抗逆性有關(guān)的基因，但有關(guān)畜禽IL8RB基因的多態(tài)對(duì)生產(chǎn)性能的影響極少報(bào)道.IL8RB基因主要分布于中性粒細(xì)胞和髓樣前體細(xì)胞系中，具有介導(dǎo)活化中性粒細(xì)胞的作用，可促進(jìn)脫顆粒，釋放貯存酶，增強(qiáng)吞噬功能，啟動(dòng)超氧離子釋放，導(dǎo)致機(jī)體局部炎癥反應(yīng)，達(dá)到殺滅病原菌的目的[16-17]，IL-8真核表達(dá)質(zhì)粒作為免疫增強(qiáng)劑能夠顯著提高家禽的抗體效價(jià)水平[18].目前，已經(jīng)在人體IL8RA基因中鑒定出了SNP，并發(fā)現(xiàn)這些SNP與炎性疾病相關(guān)，并且已經(jīng)顯示其在不同的地理種群中有所不同[19-20].徐敏等[21]報(bào)道，CXCR2基因可以作為影響牛乳房炎和奶品質(zhì)性狀的可能主要候選基因，并將SNP+777和SNP+861兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)用于抗乳房炎性狀的選擇.本研究以貴州地方雞種長(zhǎng)順綠殼蛋雞、黔畫(huà)烏雞和威寧雞為材料，對(duì)IL8RB基因進(jìn)行SNP檢測(cè)，在IL8RB基因外顯子2上共篩選出2個(gè)SNP變異位點(diǎn)g.22589443 C>T和g.22589512 C>T.g.22589443 C>T突變共產(chǎn)生3種基因型，引起亮氨酸變成絲氨酸；g.22589512 C>T突變共產(chǎn)生2種基因型，引起蘇氨酸變成甲硫氨酸.g.22589443 C>T突變位點(diǎn)的雜合度和有效等位基因數(shù)較高，為中度多態(tài)，更利于遺傳選擇，在今后的遺傳選育工作中獲得更大遺傳進(jìn)展的潛力更大[22].2個(gè)SNP位點(diǎn)聯(lián)合產(chǎn)生3種單倍型和4種雙倍型，理論上應(yīng)有4種單倍型和10種雙倍型，實(shí)際觀察值與理論值存在差異，可能由長(zhǎng)期人工選育、樣本量不夠或者根本不存在另外一種單倍型引起的.基因在配子中的隨機(jī)分離及在合子中的隨機(jī)重組都會(huì)導(dǎo)致一定的誤差，引起基因頻率的變化，即隨機(jī)漂變引起基因頻率偏離Hardy-Weinberg平衡[23].本研究中,g.22589443 C>T位點(diǎn)的基因型分布在長(zhǎng)順綠殼蛋雞中極顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)，在黔畫(huà)烏雞和威寧雞中顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)；而g.22589512 C>T位點(diǎn)的基因型分布在3個(gè)雞種群中均未偏離Hardy-Weinberg平衡(P>0.05).表明g.22589443 C>T位點(diǎn)可能受到遺傳漂變、突變或者人工選育等因素的影響[24].r2和D′值反映了連鎖不平衡的不同方面，D′值僅包括重組史，而r2值包括了重組史和突變史以及諸如自然或人工選擇、基因轉(zhuǎn)換、遺傳漂變等可以影響連鎖不平衡的歷史事件，D′值不適宜小樣本的研究應(yīng)用，r2值小于0.33時(shí)，位點(diǎn)之間不存在強(qiáng)連鎖不平衡[25]，表明該基因2個(gè)SNP位點(diǎn)趨向獨(dú)立遺傳.基因突變使IL8RB基因mRNA最小自由能降低，穩(wěn)定性升高，2個(gè)SNP位點(diǎn)雖然引起氨基酸變化，但蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)并未改變，蛋白質(zhì)的功能與其空間結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系，因此，突變沒(méi)有引起蛋白質(zhì)功能和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變.對(duì)IL8RB基因變異位點(diǎn)與黔畫(huà)烏雞肉品質(zhì)關(guān)聯(lián)性的分析發(fā)現(xiàn)，H1H1(CCCC)個(gè)體的肉色指標(biāo)顯著高于H1H3(CCCT)個(gè)體(P<0.05)，且雙倍型H1H1各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍，雙倍型H1H1是改善肉色的有利雙倍型.今后可以加大對(duì)IL8RB基因SNP的研究并擴(kuò)大篩查范圍，對(duì)其多態(tài)性進(jìn)行更深層次的探討與分析，為雞的保種選育提供參考.