入侵性食葉害蟲椰子織蛾的單倍型多樣性分析

李優(yōu)佳，楊 帆，呂寶乾，何榮曉，蔡 波

(1 海南大學(xué) 林學(xué)院，海南 海口 570228； 2 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101； 3 ?？诤ｊP(guān) 熱帶植物隔離檢疫中心，海南 ?？?570311)

全球變暖和日益頻繁的國(guó)際貿(mào)易活動(dòng)加速了外來(lái)物種的入侵，且對(duì)當(dāng)?shù)厣锒鄻有?、生態(tài)系統(tǒng)和作物生產(chǎn)構(gòu)成重大威脅，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。椰子織蛾Opisina arenosella是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)危害棕櫚科植物的入侵性食葉害蟲，最早于19世紀(jì)中期在印度和斯里蘭卡被發(fā)現(xiàn)，此后相繼在緬甸、印度、孟加拉、印度尼西亞、泰國(guó)、馬來(lái)西亞、巴基斯坦等地發(fā)生為害[2-4]。在我國(guó)，該蟲于2013年8月首次在海南省萬(wàn)寧市被發(fā)現(xiàn)，隨后快速擴(kuò)散至廣東、廣西和福建等地[5-6]。椰子織蛾可危害不同年齡的棕櫚科Palmae植物，幼蟲從棕櫚科植物的下部老葉逐步向上取食，向新葉擴(kuò)展，幼蟲將葉肉吃光，形成干枯狀，幼蟲排出的糞便會(huì)在葉片背面形成織絲蟲道，幼蟲在里面潛行，危害嚴(yán)重時(shí)使下部的葉片焦枯如火燒狀，甚至使植株整個(gè)樹冠葉片干枯，在短期內(nèi)就能造成樹體死亡[4]。此外，椰子織蛾成蟲具有較強(qiáng)飛翔能力，可進(jìn)行遠(yuǎn)距離擴(kuò)散[7]。

目前關(guān)于椰子織蛾的研究主要集中在化學(xué)防治[8]、生物防治[9-10]和生物學(xué)特性等[11-12]方面，有關(guān)地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)以及分化方面的研究報(bào)道較少。分子標(biāo)記技術(shù)已越來(lái)越多應(yīng)用于入侵害蟲的研究工作中，如美國(guó)白蛾Hyphantria cunea[13]、舞毒蛾Lymantria dispar[14]、瓜實(shí)蠅Bactrocera cucuribitae[15]和美洲斑潛蠅Liriomyza sativae[16]等。線粒體COI基因是目前使用最廣泛的分子標(biāo)記之一，常被應(yīng)用于分析入侵物種的遺傳變異、種群結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育和系統(tǒng)地理模式等，對(duì)于揭示入侵種群的起源、種群基因交流、災(zāi)變遺傳機(jī)制與分子進(jìn)化等具有重要意義[17-18]。

本研究采用COI基因片段對(duì)國(guó)內(nèi)10個(gè)地區(qū)及國(guó)外3個(gè)地區(qū)的椰子織蛾種群進(jìn)行單倍型檢測(cè)，并與其他地區(qū)公布的椰子織蛾序列進(jìn)行比較分析，探討入侵中國(guó)的椰子織蛾的蟲源信息，了解擴(kuò)張歷史，進(jìn)一步預(yù)測(cè)該蟲的入侵發(fā)展途徑，為椰子織蛾綜合防治策略的提出提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

本研究的椰子織蛾來(lái)自入侵地中國(guó)海南和廣東以及馬來(lái)西亞、泰國(guó)和原產(chǎn)地印度等16個(gè)地區(qū)，共采集172個(gè)樣本，其中序號(hào)12～16的種群序列從GenBank下載獲得。將采集的新鮮樣品浸泡于無(wú)水乙醇，–20 ℃冰箱保存，備用。所采集的樣本均有定位信息并進(jìn)行了標(biāo)注，詳細(xì)樣本采集信息列于表1。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

基因組DNA的提取參考印紅等[19]、張德華等[20]的方法。所有樣品的DNA質(zhì)量在超微量紫外分光光度計(jì)(生產(chǎn)于上海尤尼柯UV-3802S)下測(cè)定，D260nm/D280nm比值均在 1.7～2.0，提取的 DNA 稀釋至 500 ng /μL，?20 ℃ 條件下保存，備用。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)椰子織蛾線粒體COI基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)増片段長(zhǎng)度為1 152 bp特異性引物。引物序列分別為正向引物: 5′-TTTTTGGAA TTTGAGCAGGA-3′，反向引物: 5′-GGGATAATCC GGTAAAAAGAGG-3′。COI基因PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括 2×TaqPlus Master Mix 10.0 μL、上游引物 0.8 μL、下游引物 0.8 μL、Template 1.0 μL (0.1 μg)、ddH2O 7.4 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃ 變性 30 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，15 個(gè)循環(huán) (每個(gè)循環(huán)降 1 ℃)；95 ℃ 預(yù)變性 30 s，50 ℃ 變性 30 s，72 ℃退火 60 s，28 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，最后修復(fù)延伸10 min。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用BioEdit軟件對(duì)測(cè)序獲得的COI基因序列進(jìn)行人工修正和序列對(duì)比[21]。使用TCS 1.21構(gòu)建置信度為90%的簡(jiǎn)約單倍型網(wǎng)絡(luò)[22]?；诘任换蝾l率的方法，運(yùn)用 Dna SP v5.10 軟件對(duì)入侵地區(qū)的種群進(jìn)行中性檢驗(yàn)，分析群體歷史動(dòng)態(tài)，同時(shí)分析每個(gè)地理種群中的單倍型組成及各個(gè)單倍型在所有地理種群中的分布情況。

表1 不同地理種群椰子織蛾樣本信息Table 1 Sample information of Opisina arenosella from different geographical populations

2 結(jié)果與分析

本研究共獲得172條來(lái)自16個(gè)不同地理種群的椰子織蛾線粒體COI序列，其中154條在本次試驗(yàn)中獲得，經(jīng)過(guò)比對(duì)和引物刪除，片段長(zhǎng)度約為1 080 bp；18 條從 GenBank 下載獲得，片段長(zhǎng)度為625 bp。172條序列共鑒定出12個(gè)單倍型(圖1)，構(gòu)成2個(gè)明顯的單倍型分支，其中1個(gè)分支為單倍型HAP，由144個(gè)樣本共享，包括海南瓊海(HNQH)、海南陵水(HNLS)、海南?？?HNHK)、海南文昌(HNWC)、海南萬(wàn)寧 (HNWN)、海南三亞 (HNSY)、廣東佛山(GDFS)，以及馬來(lái)西亞吉隆坡(MLSY)、泰國(guó)北碧府(TLBB)(表2)；另1個(gè)分支由11個(gè)單倍型IN1-IN11組成，均來(lái)自印度種群，單倍型IN1是印度6個(gè)地區(qū)椰子織蛾的共享單倍型，IN2-IN11均為獨(dú)享單倍型，不與其他種群共享。

圖1 椰子織蛾12個(gè)COI單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化關(guān)系圖Fig. 1 Evolution diagram of 12 COI haplotypes of Opisina arenosella

表2 椰子織蛾12個(gè)COI單倍型在不同地區(qū)的分布Table 2 Distribution of 12 Opisina arenosella COI haplotypes in different regions

序列對(duì)比顯示COI單倍型包含15個(gè)變異位點(diǎn)(圖2)，其中，73%是堿基轉(zhuǎn)換，27%是堿基顛換。11個(gè)來(lái)自印度的單倍體（IN1～I(xiàn)N11）與分布在中國(guó)、馬來(lái)西亞和泰國(guó)的單倍體HAP存在4個(gè)變異位點(diǎn)，位點(diǎn)17的堿基為嘌呤轉(zhuǎn)換，位點(diǎn)161、257和608的堿基為嘧啶轉(zhuǎn)換。

圖2 椰子織蛾COI單倍型變異位點(diǎn)分布Fig. 2 Variable site distribution of Opisina arenosella COI haplotypes in different regions

對(duì)入侵地區(qū)椰子織蛾種群基于等位基因頻率的中性檢驗(yàn)并結(jié)合錯(cuò)配分布的分析結(jié)果顯示，Tajima’sD值為 ?1.159 67(P>0.05)，F(xiàn)u’s Fs 值為?3.515(P>0.05)，二者均為負(fù)值，但分化值不顯著。錯(cuò)配分布圖(圖3)顯示，16個(gè)種群的所有單倍型的歧點(diǎn)先形成L形，而后出現(xiàn)單峰分布曲線，表明椰子織蛾在整體水平上并未出現(xiàn)快速擴(kuò)張等歷史事件。

圖3 基于等位基因頻率的172個(gè)椰子織蛾樣本的錯(cuò)配分布圖Fig. 3 Distribution of mismatch in 172 Opisina arenosella samples based on allele frequency

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)16個(gè)椰子織蛾種群的172個(gè)樣本COI序列進(jìn)行分析，所有序列無(wú)插入或缺失現(xiàn)象，并且 A+T 平均占比為68.9%，明顯高于G+C 占比(31.1%)，表現(xiàn)出A+T堿基偏嗜，符合昆蟲線粒體DNA堿基組成結(jié)構(gòu)[23]。將所有個(gè)體作為整體進(jìn)行中性檢測(cè)分析，種群未經(jīng)歷大規(guī)模的擴(kuò)張，單倍型IN1在印度種群中廣泛分布，并作為中心向其他單倍型發(fā)散，推斷IN1是祖先單倍型；單倍型HAP則形成另一分支，并由中國(guó)、馬來(lái)西亞和泰國(guó)的種群共享，表明入侵地區(qū)的椰子織蛾種群為同一基因類型或者有相同的入侵源，且該基因型在入侵地區(qū)快速繁殖和擴(kuò)散，說(shuō)明具有較高的適應(yīng)和競(jìng)爭(zhēng)能力。椰子織蛾在入侵地區(qū)未形成遺傳分化，分析原因可能是椰子織蛾入侵我國(guó)的時(shí)間較短，新棲息地的地理環(huán)境相似，尚未積累豐富的遺傳變異。

遺傳變異是物種適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)，當(dāng)面臨新的環(huán)境條件時(shí)，豐富的遺傳變異為物種適應(yīng)新環(huán)境提供了選擇材料。因此，較高的遺產(chǎn)變異可以增強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)能力。然而，高水平的遺傳多樣性并非成功入侵的必要條件[24]。外來(lái)物種在入侵過(guò)程中常伴隨奠基者效應(yīng)，導(dǎo)致遺傳多樣性水平降低[25-26]。一些入侵物種遺傳多樣性的降低反而促進(jìn)其成功入侵。如阿根廷螞蟻Linepithema humile入侵北美，其遺傳多樣性的降低減少了種群內(nèi)部斗爭(zhēng)，因此提高了種群的生存與繁殖能力，在數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢(shì)，從而形成了有利于在新環(huán)境中競(jìng)爭(zhēng)的行為特性[27]。在本研究中，入侵中國(guó)、馬來(lái)西亞、泰國(guó)等地區(qū)的椰子織蛾種群中僅檢測(cè)到一種COI基因型，原產(chǎn)地印度椰子織蛾種群的多態(tài)位點(diǎn)顯著多于入侵地區(qū)種群的，表明椰子織蛾入侵后遺傳多樣性下降，種群經(jīng)歷了奠基者效應(yīng)。一些理論研究表明，入侵過(guò)程的瓶頸效應(yīng)可以增加性狀的遺傳變異[28]或改變遺傳背景[29]。外來(lái)物種在入侵過(guò)程中通過(guò)與轉(zhuǎn)座子的相互作用影響基因組結(jié)構(gòu)、組織和功能，從而促進(jìn)快速適應(yīng)，特別是在遺傳多樣性低的群體中。應(yīng)激誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)座子活性變化可以改變基因作用，并促進(jìn)遺傳變異，有助于遺傳多樣性低的物種能夠在新環(huán)境中快速適應(yīng)[30-31]，使群體達(dá)到新的適應(yīng)高峰。入侵地區(qū)與原產(chǎn)地印度的椰子織蛾單倍型均存在4個(gè)堿基位點(diǎn)的差異，推測(cè)是椰子織蛾種群受環(huán)境選擇壓力影響，在新棲息地產(chǎn)生了新的突變或雜交。有研究已證實(shí)線粒體的基因突變可以影響與生物學(xué)特性有關(guān)的表型變化，如灰飛虱Laodelphax striatellus在我國(guó)存在2種不同的線粒體單倍型群(HGI、HGII)，而這2種單倍型灰飛虱在產(chǎn)卵量和壽命等方面存在顯著差異，灰飛虱線粒體DNA的變異導(dǎo)致了DNA復(fù)制能力的提高，使其能夠抵御遺傳漂變作用而被保留下來(lái)；同時(shí)這些變異帶來(lái)了生殖和耐寒力方面的優(yōu)勢(shì)，使其能夠在種群中得到擴(kuò)散[32]。

在我國(guó)，椰子織蛾主要分布在緯度23.5°N以南的局部地區(qū)，且暴發(fā)為害多發(fā)生在以棕櫚植物種植為主的公園、國(guó)道以及濱江濱海綠化帶[33]。據(jù)報(bào)道，椰子織蛾分布最北的地區(qū)為印度德里，緯度約為28.6°N[34]。因此，椰子織蛾在我國(guó)可能向北持續(xù)擴(kuò)散，且隨著全球變暖日益嚴(yán)重，該蟲向北擴(kuò)散蔓延的速度將進(jìn)一步加快。本研究分析了3個(gè)入侵國(guó)家的椰子織蛾單倍型，該信息對(duì)精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)椰子織蛾，綜合分析其侵入來(lái)源和擴(kuò)散路徑具有重要指導(dǎo)意義。