許雪皎，李復(fù)琴，鄧軍，樊仙，李如丹，張躍彬，刀靜梅，楊紹林，全怡吉

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南開(kāi)遠(yuǎn) 661699；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，昆明 650201）

0 引言

甘蔗生長(zhǎng)所必需的三大營(yíng)養(yǎng)元素氮、磷、鉀主要由土壤提供，研究結(jié)果表明，磷鉀可使甘蔗的糖分含量增加，氮鉀則可促進(jìn)甘蔗的莖徑和莖長(zhǎng)的增長(zhǎng)，對(duì)提高甘蔗的產(chǎn)量有顯著效果[1]。由此可見(jiàn)，磷對(duì)甘蔗生長(zhǎng)有重要的影響。在石灰性土壤中，通常含有較高的鈣離子，易與磷酸根離子形成磷酸鈣的沉淀，從而降低磷的有效性，造成蔗區(qū)土壤磷素匱乏[2]。甘蔗生產(chǎn)施肥主要是依靠土壤養(yǎng)分分析研究和生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo)[3]，因此，測(cè)定蔗區(qū)土壤有效磷含量，為提高甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)、合理施肥提供科學(xué)依據(jù)，均有很重要的意義[4]。

我們通常所說(shuō)的土壤有效磷不是指某一種特定形態(tài)的磷，它沒(méi)有真正的“數(shù)量”概念，同一土壤用不同的方法可測(cè)出不同數(shù)量的有效磷，所以，我們通常所檢測(cè)的土壤有效磷只是表示一個(gè)相對(duì)指標(biāo)，在一定程度上只有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而不能判定為土壤中“真正”有效磷的“絕對(duì)含量”。但這項(xiàng)指標(biāo)能在一定程度上體現(xiàn)出土壤的磷含量，可用來(lái)判斷是否施用磷肥[5]，也可作為施磷肥的推薦方法[6]。測(cè)定土壤有效磷的方法有碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法（簡(jiǎn)稱(chēng)Olsen 法）、Bray 1 法、樹(shù)脂法等，由于Olsen 法與作物對(duì)磷肥的反應(yīng)相關(guān)性好，適用范圍廣，所以普遍用于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)土壤有效磷的檢測(cè)，為了提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，減少勞動(dòng)量和強(qiáng)度，筆者對(duì)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中影響Olsen法測(cè)定結(jié)果的幾個(gè)因素進(jìn)行了分析討論，為使用該法測(cè)定有機(jī)磷時(shí)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

1.1.1 材料

土壤樣品取于2019 年云南蔗區(qū)實(shí)際待檢土樣11 個(gè)（編號(hào)：2019001、2019002、2019003、2019004、2019005、2019006、2019007、2019008、2019009、2019010、2019011），自制參比土樣（編號(hào)：2014F391）和已知有效磷含量（29±3）mg/kg的有證標(biāo)準(zhǔn)土樣（編號(hào)：GBW07414）。所有土樣均經(jīng)過(guò)自然風(fēng)干，磨細(xì)，過(guò)2 mm篩孔處理，試驗(yàn)用土壤pH測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 土壤樣品pH 值Table 1 The pH value in soil sample

1.1.2 儀器

電子天平，梅特勒，型號(hào)：PL2002/01；分光光度計(jì)，上海菁華，型號(hào)：722；全溫度振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市華美生化儀器廠，型號(hào)：QHZ-98A；實(shí)驗(yàn)室常用容量瓶、移液管等器具及設(shè)備。

1.1.3 試劑溶液

本文所用試劑和水均嚴(yán)格按土壤有效磷檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[7]的要求配制和取用：鉬銻貯備液；鉬銻抗顯色劑；抗壞血酸（左旋，旋光度+21～22°）；2，4-二硝基酚指示劑；碳酸氫鈉浸提劑（0.5 mol/L，pH8.5）；無(wú)磷活性碳粉；磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液（P=100 mg/L）；無(wú)磷濾紙。

1.2 有效磷的浸提

稱(chēng)取2.50 g 風(fēng)干土樣于干燥的200 mL 塑料瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL 25±1℃濃度為0.5 mol/L 的碳酸氫鈉浸提劑，蓋緊瓶蓋，混勻并把塑料瓶固定好，以保證樣液充分混勻且在振蕩過(guò)程中不撒漏。然后在溫度25±1℃，振蕩頻率180±20 r/min 的全溫度振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩25～30 min，振蕩結(jié)束后，用無(wú)磷濾紙干過(guò)濾至濾液清澈。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.3 濾出液中有效磷的測(cè)定

1.3.1 待測(cè)液的準(zhǔn)備

⑴待測(cè)液的吸取：用干凈的刻度移液管準(zhǔn)確吸取5.00 mL濾液于50 mL容量瓶中；如果土壤有效磷含量較高，可以減少濾液的吸取量，但必須保持顯色時(shí)溶液的酸度。計(jì)算結(jié)果要按所取濾液的分取倍數(shù)計(jì)算。

⑵調(diào)色：加入顯色劑前，先將10 mL左右的水加入裝有5.00 mL濾液的容量瓶中，再加2～3滴2，4-二硝基酚指示劑，然后用稀硫酸溶液和稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至微黃色[9]。

⑶趕氣泡：將5.00 mL鉬銻抗顯色劑緩慢加入調(diào)好色的濾液中，由慢到快搖動(dòng)容量瓶，直至氣泡消失，CO2氣體充分排除（要防止產(chǎn)生的CO2氣泡溢出瓶口，影響測(cè)定結(jié)果），然后定容，蓋緊瓶蓋，搖勻待測(cè)。

1.3.2 有效磷的顯色測(cè)定

將定容好的待測(cè)液置于室溫高于25℃的條件下靜置30 min，同時(shí)預(yù)熱分光光度計(jì)，用1 cm光徑比色皿在波長(zhǎng)700 nm 處，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的零點(diǎn)調(diào)零后進(jìn)行比色測(cè)定，在測(cè)定過(guò)程中，始終保持比色皿的光滑面對(duì)準(zhǔn)光路，手持毛面，擦干比色皿外側(cè)液體后再將其放入比色槽，以標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點(diǎn)調(diào)零后再進(jìn)行比色測(cè)定；并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出磷含量；同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。測(cè)定過(guò)程中比色皿被鉬藍(lán)染色則會(huì)造成濾液的顯色色值偏大，所以如果發(fā)現(xiàn)比色皿被鉬藍(lán)污染，可用棉棒沾酒精清洗干凈后用純水反復(fù)沖洗干凈，再倒入待測(cè)液進(jìn)行測(cè)定。

1.4 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在土樣測(cè)定的同時(shí)，吸取5.00 mL 磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液（P=100 mg/L）于100 mL 容量瓶中，用水定容搖勻得到5.00 mg/L 的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（P=5 mg/L）0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 于50 mL容量瓶中，加入5.00 mL碳酸氫鈉浸提劑，2～3滴2，4-二硝基酚指示劑，然后用稀硫酸溶液和稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至微黃色，再加入5.00 mL 鉬銻抗顯色劑，緩慢搖動(dòng)排除CO2后加水定容，即得到含磷0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L 的磷標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，用分光光度計(jì)波長(zhǎng)在700 nm 處測(cè)定試樣吸光度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。r=0.999，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果比較準(zhǔn)確。

表2 磷測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curve for determination of phosphorus

1.5 測(cè)定結(jié)果計(jì)算

土壤中有效磷（P）的含量（mg/kg）計(jì)算：P(mg/kg)=

式中：ρ是從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的顯色液中磷的濃度（mg/L）；ρ0是從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的空白試樣中磷的濃度（mg/L）；V是顯色液體積（mL）；D是分取倍數(shù)，試樣浸提劑體積與分取體積之比；1000是將mL換算成L和將g換算成kg的系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 比色皿對(duì)吸光度測(cè)定的影響

比色皿有不同的光程長(zhǎng)度，一般常用的有0.5、1、2、3 cm 光程長(zhǎng)度等，選擇何種光徑的比色皿是根據(jù)分析樣品的吸光度而定。當(dāng)樣品濃度較小時(shí)，應(yīng)選用光程長(zhǎng)度較大的如2、3 cm比色皿；當(dāng)樣品濃度較大時(shí)，可選用光程長(zhǎng)度較小的如1 cm比色皿。不同濃度下的測(cè)定誤差也不同，選擇最適宜的測(cè)定濃度可以減少測(cè)定誤差，吸光值在0.1～0.7 之間時(shí)，測(cè)定誤差相對(duì)較小，所以我們?cè)谶x擇比色皿時(shí)，應(yīng)使所測(cè)溶液的吸光值在0.1～0.7之間。通過(guò)比較1、2、3 cm三種不同光程長(zhǎng)度的比色皿對(duì)10個(gè)蔗區(qū)待測(cè)土壤樣品檢測(cè)有效磷吸光度的測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)（表3），選用1 cm 的比色皿比色時(shí)，所測(cè)樣液的吸光值為0.1～0.7；選用2、3 cm 的比色皿比色時(shí)，有部分土壤吸光值超出0.7；為減少測(cè)定誤差，故在檢測(cè)蔗區(qū)該批次土壤樣有效磷時(shí)應(yīng)選用光程長(zhǎng)度較小的1 cm 比色皿。比色皿均有方向性，在檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格按方向標(biāo)記使用；清洗比色皿時(shí)可用稀硝酸（1%）或者無(wú)水乙醇浸泡片刻，除去吸附在皿壁的鉬藍(lán)物質(zhì)，然后用純水反復(fù)沖洗干凈[10]。

表3 不同光程長(zhǎng)度比色皿測(cè)定土壤吸光值Table 3 Determination of soil absorbance by cuvette of different lengths range

2.2 土液比對(duì)浸提效果的影響

通過(guò)對(duì)土壤樣品在不同土液比下浸提測(cè)定結(jié)果的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Olsen法中土液的比值可直接影響磷的浸提效果（表4），土液比越大，浸提效果越不明顯，土液比低于1∶20，雖然浸提效果明顯，卻存在濾液過(guò)少的情況；故在檢測(cè)中，我們要按照標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格將土液比控制在1∶20，保證濾液充足且浸提完全。稱(chēng)取土樣時(shí)要先將校準(zhǔn)過(guò)的電子天平預(yù)熱30 min，加入浸提劑后，要將瓶蓋擰緊并上下?lián)u動(dòng)多次，保證樣液充分混勻。

表4 土壤樣品2014F391 土液比對(duì)浸提效果的影響Table 4 Effect of soil sample(2014F391) to liquid ratio on extraction

2.3 振蕩時(shí)間的控制

磷溶解作用和交換作用都與作用時(shí)間有關(guān)，通過(guò)對(duì)土壤樣品、自制參比土樣和已知有效磷含量29±3 mg/kg 的有證標(biāo)準(zhǔn)土樣在振蕩時(shí)間選擇的研究中發(fā)現(xiàn)（表5）；土壤質(zhì)量2.50 g，土液比1∶20的同等條件下，振蕩時(shí)間低于25 min時(shí)，磷的浸出不充分，磷結(jié)果偏低；振蕩時(shí)間越久，磷檢測(cè)結(jié)果就越高，數(shù)據(jù)顯示振蕩時(shí)間為30 min時(shí)浸提結(jié)果比較接近各土壤樣品磷含量的標(biāo)準(zhǔn)值，故振蕩時(shí)間控制在30 min最適宜。

表5 不同振蕩時(shí)間提取土壤有效磷的檢測(cè)結(jié)果Table 5 Results of available phosphorus extracted from soil at different oscillation time

2.4 振蕩頻率的選擇

根據(jù)對(duì)已知有效磷含量29±3 mg/kg 的有證標(biāo)準(zhǔn)土樣浸提有效磷時(shí)不同振蕩頻率的研究（表6）發(fā)現(xiàn)，振蕩頻率不同會(huì)影響土壤有效磷的浸提結(jié)果；振蕩頻率慢，則測(cè)定結(jié)果會(huì)偏低；振蕩頻率越快，浸提效率越高[11]，但是頻率過(guò)快會(huì)導(dǎo)致樣液濺出，也會(huì)影響其測(cè)定結(jié)果，所以根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《土壤檢測(cè)第七部分：土壤有效磷的測(cè)定》中的規(guī)定，浸提頻率應(yīng)控制在180±20 r/min最適宜。

表6 不同振蕩頻率對(duì)土樣GBW07414 有效磷含量測(cè)定結(jié)果的影響Table 6 Effects of different oscillation frequencies on content of available phosphorus in soil sample(GBW07414)

2.5 浸提溫度的控制

用Olsen 法測(cè)定土壤有效磷時(shí)，磷測(cè)定結(jié)果會(huì)受浸提溫度和浸提液溫度的影響。張?chǎng)┑戎赋鲈?0～30℃提取溫度范圍內(nèi)，以25±1℃為標(biāo)準(zhǔn)，溫度每升高1℃，土壤有效磷檢測(cè)結(jié)果就會(huì)增加0.43 mg/kg[12]，所以，準(zhǔn)確控制浸提溫度和浸提液溫度是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要條件。

根據(jù)對(duì)自制參比土樣和已知有效磷含量29±3 mg/kg 的有證標(biāo)準(zhǔn)土樣進(jìn)行的不同浸提溫度下有效磷含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在條件相同的情況下，不同的浸提溫度會(huì)直接影響有效磷的測(cè)定結(jié)果（表7）；隨著溫度的逐步升高有效磷的結(jié)果也隨之增加，在接近25℃時(shí)，浸出磷的含量比較接近樣品標(biāo)準(zhǔn)有效磷的含量；所以浸提時(shí)，應(yīng)把振蕩箱的溫度控制在25±1℃，使浸提溫度和浸提液溫度一樣，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。冬天室溫較低時(shí)，可先把浸提劑用熱水浴的方法適當(dāng)加溫，但不能超過(guò)35℃[8]。夏季溫度較高時(shí)，則采用冷水浴的方法適當(dāng)降溫。

表7 不同浸提溫度對(duì)土壤有效磷含量測(cè)定結(jié)果的影響Table 7 Effects of different extraction temperatures on results of available phosphorus in soil

2.6 調(diào)色對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

Olsen法測(cè)定土壤有效磷是通過(guò)pH=8.5的NaHCO3溶液來(lái)提取土壤中的有效磷，石灰性土壤中的磷，多以磷酸一鈣和磷酸二鈣的形態(tài)存在，pH=8.5 的NaHCO3提取土壤有效磷時(shí)，由于碳酸根的同離子效應(yīng)，碳酸鈣的溶解度會(huì)降低，隨之溶液中鈣的濃度也會(huì)降低，既有利于磷酸鈣鹽的提取，又能使碳酸氫鈉堿溶液中的HCO3-、CO32-等陰離子有利于吸附態(tài)磷的置換；在偏酸性土壤中pH 的升高會(huì)使磷酸鋁和磷酸鐵（Fe-P、Al-P） 水解而部分被提取，在浸提液中由于Al、Ca、Fe 濃度較低，不會(huì)產(chǎn)生磷的再沉淀[6]，故可以用鉬銻抗顯色測(cè)出浸提液中的磷含量。

通過(guò)對(duì)4 個(gè)待檢土樣、自制參比土樣和已知有效磷含量（29±3）mg/kg 的有證標(biāo)準(zhǔn)土樣浸提后直接濾液與調(diào)色后濾液的pH 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（表8），由于浸提時(shí)對(duì)浸提液pH 的嚴(yán)格控制，所以濾液的pH 呈堿性，而磷鉬雜多酸的生成需要合適的酸度條件，過(guò)酸或不足都會(huì)影響顯色效果，所以在磷的鉬藍(lán)比色測(cè)定中，酸度的控制極其重要，故為了保持顯色時(shí)待測(cè)液的酸度，在加入顯色劑前，需要先調(diào)節(jié)浸提液的pH 至微黃色，讓鉬藍(lán)顯色在特定的酸度條件下發(fā)生，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表8 直接濾液與調(diào)色后濾液的pH 值對(duì)比Table 8 Comparison of pH between direct filtrate and modified filtrate

2.7 吸收波長(zhǎng)的選擇

分光光度法是依據(jù)比爾定律，通過(guò)測(cè)定待檢物質(zhì)在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)或特定波長(zhǎng)處光的吸收度,來(lái)對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定量和定性分析的方法；不同的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)對(duì)待測(cè)液吸收波長(zhǎng)的要求有所不同[12],在測(cè)試之前，通過(guò)對(duì)已知有效磷含量29±3 mg/kg的有證標(biāo)準(zhǔn)土樣待測(cè)液吸收光譜的測(cè)定（表9）,在700 nm處吸光度最大，選擇最大吸收波長(zhǎng)700 nm處作為本實(shí)驗(yàn)的測(cè)量波長(zhǎng)[13]，從而獲得較高的靈敏度及較好的線性關(guān)系。

表9 標(biāo)準(zhǔn)土樣（GBW07414）在不同波長(zhǎng)下測(cè)定的吸光度Table 9 Absorbance of standard soil samples(GBW07414) at different wavelengths

2.8 Olsen法檢測(cè)有效磷含量的精密度

通過(guò)對(duì)蔗區(qū)部分土壤、有證標(biāo)準(zhǔn)土樣有效磷檢測(cè)，在室內(nèi)溫度為25℃，稱(chēng)取待檢土樣4 個(gè)，編號(hào)分為：2019001、2019002、2019003、2019004，自制參比土樣（編號(hào)：2014F391）和已知有效磷含量29±3mg/kg 的有證標(biāo)準(zhǔn)土樣（編號(hào)：GBW07414）各2.50 g，每個(gè)樣品平行測(cè)定5 次，用1 cm 比色皿比色，土液比1∶20，振蕩時(shí)間為30 min，轉(zhuǎn)速180±20 r/min，浸提溫度25±1℃；用Olsen法檢測(cè)其有效磷含量。由表10可知，6組土壤樣品測(cè)定有效磷含量的RSD為0.41%～1.22%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

表10 蔗區(qū)土壤樣品有效磷精密度測(cè)定結(jié)果Table 10 Results of available phosphorus density of soil samples in sugarcane area

3 討論與結(jié)論

本文主要討論了影響有效磷測(cè)定結(jié)果的幾個(gè)因素。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得知碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法中使用碳酸氫鈉浸提劑浸提時(shí)，要嚴(yán)格控制土液比1∶20，振蕩時(shí)間30 min和頻率180±20 r/min，浸提溫度25±1℃，用1 cm 比色皿測(cè)吸光值等幾個(gè)關(guān)鍵的因素；重點(diǎn)研究了調(diào)色對(duì)濾液待測(cè)液pH 的影響，因浸提環(huán)境的限制，濾液的pH 呈堿性，所以在加入顯色劑前通過(guò)調(diào)色使待測(cè)液達(dá)到適合鉬藍(lán)顯色的特定酸度條件，再用加入抗壞血酸的鉬銻抗溶液作為顯色劑，可以使顯色在短時(shí)間內(nèi)完成，且生成的顏色較穩(wěn)定，提高了實(shí)驗(yàn)效率；本文通過(guò)對(duì)紫外可見(jiàn)波長(zhǎng)全掃描，找到最大吸收峰的波長(zhǎng)700 nm 作為本實(shí)驗(yàn)的波長(zhǎng)，測(cè)得6 組土壤樣品的RSD為0.41%～1.22%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。與NY/T 1121.7-2014相比，本方法縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，優(yōu)化了環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)的限制。

按照樣品分析的全部步驟，重復(fù)n（n≥7）次空白試驗(yàn)將各測(cè)定結(jié)果換算為樣品中的濃度，計(jì)算n次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按下列公式計(jì)算方法檢出限：MDL=t(n-1，0.99)×S（式中：n是樣品的平行測(cè)定次數(shù)；t是自由度為n-1，置信度為0.99 時(shí)的t分布，S是n次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差）。當(dāng)n=7 時(shí)，t=3.143，以4倍檢出限作為方法測(cè)定下限，檢出限為0.47 mg/kg，檢出下限為1.90 mg/kg；較傳統(tǒng)Olsen法，該方法顯色快，顯色效果好，生成的顏色較穩(wěn)定，受干擾離子小，在室溫下也能顯色；檢出限、準(zhǔn)確度、精密度均較好，同時(shí)也滿足了土壤有效磷測(cè)定的要求，可廣泛應(yīng)用于對(duì)中性、微酸性和石灰性土壤有效磷的檢測(cè)，更好地為蔗農(nóng)進(jìn)行平衡施肥提供準(zhǔn)確的理論依據(jù)。