張 婧，王玉銀，，魏文悅，郭敏芳，楊德兵，馬存根，*，尉杰忠，3*

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西太原 030024;2.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西大同 037009;3.山西大同大學(xué)附屬第一醫(yī)院，山西大同 037009）

許多研究表明小膠質(zhì)細胞在阿爾茨海默病(Al?zheimer disease，AD)等多種認知功能障礙的疾病過程中發(fā)揮重要作用。小膠質(zhì)細胞通過吞噬清除和提供營養(yǎng)來維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。激活的小膠質(zhì)細胞具有2種完全相反的狀態(tài)及機制[1]：一方面小膠質(zhì)細胞會產(chǎn)生大量的促炎因子如白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleu?kin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis fac?tor-α，TNF-α）等，并產(chǎn)生活性氧ROS和一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）從而損害神經(jīng)元和大腦組織；另一方面小膠質(zhì)細胞會在腦內(nèi)清除吞噬Aβ，減少神經(jīng)損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護的作用[2]。因此，小膠質(zhì)細胞最近已經(jīng)成為AD發(fā)病機制研究中的關(guān)鍵角色。

研究表明法舒地爾（fasudil）可減輕免疫炎癥反應(yīng)，恢復(fù)神經(jīng)功能，改善AD疾病模型的學(xué)習(xí)認知能力[3]，還可以促進神經(jīng)元再生，減少腦內(nèi)Aβ-42的生成[4]，通過側(cè)腦室注射還可促進錐體突觸伸長[5]。

基于以上研究，我們通過脂多糖（LPS）激活原代小膠質(zhì)細胞來研究法舒地爾對細胞炎癥水平的影響，以及對Aβ的吞噬作用，并研究其可能的作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)法舒地爾可以降低原代小膠質(zhì)細胞的促炎因子水平，提高原代小膠質(zhì)細胞的Aβ吞噬能力，下調(diào)小膠質(zhì)細胞HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性來降低糖酵解過程相關(guān)酶的相對表達量，抑制糖酵解的過程，從而增加ATP的產(chǎn)生，提示法舒地爾是治療AD的潛在藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

原代小膠質(zhì)細胞由山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所分離培養(yǎng)。DMEM(Gibco)培養(yǎng)基購自Life Tech?nologies Corporation，胰酶及胎牛血清購自Biologi?cal Industries，鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司，蛋白酶抑制劑cocktail購自Selleck公司，Aβ（6E10）抗體購自Covance（SIG-39320），RNA提取試劑Trizol reagent購自Thermal，One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super?mix購自全式金生物技術(shù)有限公司，染料法熒光定量PCR試劑盒ultra SYBR MIX(with ROX)購自康為世紀生物技術(shù)有限公司，ATP試劑盒CellTiter-Glo@ Luminescent Cell Viability Assay購自Pro?mega。PCR引物由primer bank以及在線Primer 3.0軟件設(shè)計并訂購于Life Technologies公司。

1.2 原代細胞培養(yǎng)

新生小鼠（出生后1～3d）剝離出大腦內(nèi)海馬組織，剪碎后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿，加入0.25%胰蛋白酶（BI）和10 μL DNAse I (10 mg/mL），置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱消化20 min后，加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中和，4 ℃800 r/ min離心5 min。棄上清，加入1 mL原代培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞稀釋后種到包被的培養(yǎng)皿中每3 d更換1次培養(yǎng)基，敲除下來即為的原代小膠質(zhì)細胞。

1.3 細胞外ATP檢測

實驗前1 d將敲下來的原代小膠質(zhì)細胞種到96孔細胞培養(yǎng)板，細胞密度介于50%～70%。細胞貼壁后，于檢測前12 h將LPS及法舒地爾加入細胞內(nèi)。在檢測時間每孔取25 μL PBS加入25 μL ATP檢測試劑，棄上清，按照試劑盒操作將配置好的工作液加入96孔板內(nèi)，靜置10 min。上清轉(zhuǎn)移至白板用酶標儀檢測，然后棄所有上清，細胞加入50 μL細胞裂解液提取蛋白?？侫TP量比總蛋白量得到細胞分泌ATP的能力。

1.4 細胞Aβ吞噬實驗

實驗前1 d將敲下來的原代小膠質(zhì)細胞種到96孔避光黑色細胞培養(yǎng)板，細胞密度介于50%～70%，并將Aβ單倍體放置于37 ℃搖床寡聚過夜。按設(shè)置時間加入藥物，于檢測前4 h將Aβ寡聚體加入，在檢測時間吸出上清，加入100 μL PBS后用酶標儀檢測發(fā)光度。Cyto D為陰性對照，而NaR為陽性對照[6]。

1.5 熒光定量PCR

取1 mg RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄按One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix進行PCR擴增，定量反應(yīng)在熒光定量PCR儀上進行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism 7.0統(tǒng)計軟件進行處理。檢測指標多組間比較采用One-Way ANOVA分析，兩兩比較采用Dunnett’sT檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 法舒地爾對LPS刺激的原代小膠質(zhì)細胞炎癥水平的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比,經(jīng)過10 μg/mL法舒地爾處理后，iNOS在LPS刺激6、12 h后的mRNA表達水平明顯下降，同時TNF-α在LPS刺激3 h時表達水平下降最為顯著，而IL-6的整體mRNA表達水平均明顯下降，見圖1。

圖1 經(jīng)法舒地爾處理后的原代小膠質(zhì)細胞在LPS刺激下促炎因子變化

2.2 法舒地爾對原代小膠質(zhì)細胞Aβ吞噬作用的影響

研究表明，在原代小膠質(zhì)細胞經(jīng)過不同濃度的法舒地爾處理后，與對照組相比，法舒地爾濃度為5 μg/mL時增加最顯著，而法舒地爾濃度為10 μg/mL時Aβ吞噬能力有明顯增加，見圖2。

圖2 原代小膠質(zhì)細胞在不同濃度的藥物處理后Aβ吞噬量變化

2.3 法舒地爾對原代小膠質(zhì)細胞新陳代謝功能的影響

結(jié)果顯示，在藥物處理后，與空白對照組相比，法舒地爾濃度為10 μg/mL時的總ATP量與總蛋白量的比值明顯升高，法舒地爾濃度為5 μg/ mL時增加最為顯著（圖3）。而在10 μg/mL法舒地爾處理后，糖酵解過程的相關(guān)酶己糖激酶1(HK1)、丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、乳酸脫氫酶(LDHA)以及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的mRNA表達水平均有不同程度的下降，其中以HK1和PGK1的下降最為顯著，見圖4。

圖3 在不同藥物濃度下原代小膠質(zhì)細胞總ATP產(chǎn)量

圖4 原代小膠質(zhì)細胞在法舒地爾處理、LPS刺激后糖酵解相關(guān)酶的mRNA變化

3 討論

免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在AD中發(fā)揮著巨大的作用[8]。我們首先構(gòu)建細胞炎癥模型，激活原代小膠質(zhì)細胞。研究發(fā)現(xiàn)用法舒地爾處理后激活原代小膠質(zhì)細胞明顯使促炎因子IL-6、TNF-α和iNOS表達水平下降。這表明，法舒地爾在原代小膠質(zhì)細胞激活后，減少了炎癥反應(yīng)。法舒地爾還可以顯著促進原代小膠質(zhì)細胞的吞噬作用，并可能通過這一途徑減少腦內(nèi)Aβ，成為治療AD的潛在藥物。

研究表明維持小膠質(zhì)細胞的新陳代謝，對清除Aβ至關(guān)重要[9-10]。我們觀察了藥物對原代小膠質(zhì)細胞代謝功能的影響，結(jié)果顯示原代小膠細胞在經(jīng)過不同濃度的法舒地爾處理后，細胞分泌ATP的能力明顯增加，說明加入藥物后細胞新陳代謝能力明顯增加。我們進一步用脂多糖（LPS）刺激原代小膠質(zhì)細胞來構(gòu)建細胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞糖酵解過程的相關(guān)酶HK1、PDK1、PGK1、LDHA以及HIF-1α的mRNA水平均有不同程度的下調(diào)，說明小膠質(zhì)細胞的糖酵解過程明顯減少。有研究顯示NFκB信號通路的活化可上調(diào)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性[7]。HIF-1α被報道是細胞能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，而高表達的HIF-1α能夠激活糖酵解相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平[11]，因此HIF-1α減少可以減少糖酵解相關(guān)酶的激活從而減弱糖酵解過程。小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)固有免疫細胞，而體內(nèi)免疫細胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)主要通過糖酵解提供能量[12]。我們的研究結(jié)果表明法舒地爾能使小膠質(zhì)細胞的糖酵解過程明顯減少，從而減少細胞炎癥的能量供給使LPS刺激的原代小膠質(zhì)細胞內(nèi)的炎癥水平下降。

總之，我們的研究表明法舒地爾可能通過下調(diào)小膠質(zhì)細胞HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性來降低糖酵解過程相關(guān)酶的表達，抑制糖酵解過程從而增加ATP的產(chǎn)生，從而維持小膠質(zhì)細胞的新陳代謝來減輕炎癥反應(yīng)，增加吞噬作用。