張 鵬，張年榮，謝紫潔，歐陽昌漢，余開湖**

(1.湖北科技學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院放射介入科)

高脂血癥是一種脂質(zhì)代謝異常疾病，患者體內(nèi)分解脂質(zhì)的脂酶活性不足或相對(duì)不足，導(dǎo)致脂質(zhì)堆積，繼而發(fā)生脂代謝紊亂及血管損傷等一系列不良后果。在一項(xiàng)對(duì)35歲以上人群血脂異?；疾÷实恼{(diào)研中發(fā)現(xiàn)，血脂異常者高達(dá)34.7 %[1]。線粒體的脂肪酸氧化是人體內(nèi)重要的生命活動(dòng)，細(xì)胞中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)也是由線粒體產(chǎn)生。受損線粒體產(chǎn)生的大量ROS是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要原因[2]。FUN14結(jié)構(gòu)域蛋白1(FUN14 domain-containing protein 1，F(xiàn)UNDC1)是一種存在于線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聯(lián)結(jié)處的自噬受體蛋白[3]，它通過與LC3-b相互作用介導(dǎo)線粒體自噬[4-5]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞缺氧的條件下，F(xiàn)UNDC1在線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聯(lián)結(jié)處積累，促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生[6]；線粒體質(zhì)量與數(shù)目失調(diào)與線粒體自噬受體FUNDC1有著重要的關(guān)聯(lián)[7]。

目前對(duì)FUNDC1在高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用研究還尚未見報(bào)道，本研究以腺病毒為載體，過表達(dá)EA.hy926人血管內(nèi)皮細(xì)胞中的FUNDC1，再加入棕櫚酸(palmitic acid，PA)建立高脂細(xì)胞模型，檢測(cè)細(xì)胞活力值、細(xì)胞ROS含量、線粒體膜電位去極化情況、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)含量以及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況來探討FUNDC1在高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；FUNDC1腺病毒(維真生物)；空載腺病毒(維真生物)；棕櫚酸(美國(guó)Sigma公司)；FUNDC1抗體(北京博奧森生物)；P62抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；LC3抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；GAPDH抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(美國(guó)Jackson公司)；cck8試劑盒(日本同仁)；細(xì)胞活性氧檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物)；JC-1試劑盒(上海碧云天生物)；ATP含量試劑盒(南京建成生物)。

1.2 儀器與設(shè)備

垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；自動(dòng)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)Syngene公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)公司)；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)；全波段多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 不同濃度PA下細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EA.hy926細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)制成5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100μL。待細(xì)胞完全貼壁，換成不同濃度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.5、0.7mmol/L)的PA培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，每孔加入cck8試劑10μL，繼續(xù)孵育1～2h，酶標(biāo)儀檢測(cè) 450nm處各孔的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 細(xì)胞分組

實(shí)驗(yàn)分為4組，對(duì)照組：EA.hy926常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)；高脂組：EA.hy926細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48 h 后，將細(xì)胞培養(yǎng)基換成0.2mmol/L PA培養(yǎng)24h；高脂+空載組：轉(zhuǎn)染空載腺病毒48h后，將細(xì)胞培養(yǎng)基換成0.2mmol/L PA培養(yǎng)24h；高脂+FUNDC1組：轉(zhuǎn)染FUNDC1腺病毒48h后，將細(xì)胞培養(yǎng)基換成0.2mmol/L PA培養(yǎng)24h。

1.3.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

在方鋼管柱兩端各布置一個(gè)位移計(jì)1、2，以測(cè)量其豎向側(cè)移；在梁端布置位移計(jì)3，以測(cè)量其水平側(cè)移，用來校準(zhǔn)作動(dòng)器位移讀數(shù)。由于連接節(jié)點(diǎn)的彎矩和轉(zhuǎn)角在試驗(yàn)中不便直接測(cè)量，本試驗(yàn)采用測(cè)量目標(biāo)位置點(diǎn)的豎向位移和測(cè)量梁端集中荷載并通過轉(zhuǎn)換計(jì)算來求得節(jié)點(diǎn)的彎矩和轉(zhuǎn)角。分別在懸臂抗剪腹板與外套筒腹板焊縫連接處、外套筒翼緣、角鋼加勁肋、外套筒腹板、方鋼管柱腹板于外套筒截面突變處、角鋼梁側(cè)鋼肢、角鋼柱側(cè)鋼肢以及梁翼緣與角鋼變截面處布置了應(yīng)變花以及應(yīng)變片。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EA.hy926細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)制成5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100μL。各組細(xì)胞相應(yīng)處理后，每孔加入 cck8試劑10μL，繼續(xù)孵育1～2h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處各孔的吸光度OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 活性氧檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EA.hy926細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接種于6孔板中。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右，各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，吸除6孔板培養(yǎng)液，以1∶1000為比例，用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，每孔加入1 ml已稀釋的DCFH-DA溶液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min，孵育結(jié)束后用無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 線粒體膜電位檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EA.hy926細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接種于6孔板中。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右，各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，吸除6孔板培養(yǎng)液，加入1mL JC-1染色工作液和1 mL DMEM培養(yǎng)基，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20min，孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1 Buffer(1×)洗滌2次，加入2mL DMEM培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 ATP含量檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EA.hy926細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接種于6孔板中。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右，各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，離心收集下層細(xì)胞沉淀，將收集好的細(xì)胞加入300μL熱雙蒸水，置于熱水浴(90℃)中勻漿破碎，后將細(xì)胞懸液于沸水浴中加熱10min，取出混勻抽提1min，依次加入ATP含量檢測(cè)試劑1～6，酶標(biāo)儀636nm處檢測(cè)吸OD值。根據(jù)公式：ATP含量(μmol/gprot)=[(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白)]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(1×103μmol/L)×樣本測(cè)定前稀釋倍數(shù)÷待測(cè)樣本蛋白濃度(gprot/L)，計(jì)算各組ATP含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western Bolt)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度PA下細(xì)胞存活率

與對(duì)照組相比，PA可明顯降低細(xì)胞存活率，并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。PA濃度為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.5、0.7mmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率分別為(80.873±1.490)%、(64.157±11.098)%、(45.883±3.645)%、(31.567±6.472)%、(25.743±3.748)%、(12.327±1.919)%、(8.207±4.743)%。PA濃度為0.2mmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為(45.883±3.645)%，與對(duì)照組相比，顯著性降低(P<0.01)，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果[8]，選用0.2mmol/L的PA濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的高脂濃度。結(jié)果見圖1。

PA濃度(mmol/L)

2.2 高脂處理后各組細(xì)胞活力

與對(duì)照組相比，高脂組和高脂+空載組細(xì)胞存活率[(45.233±0.505)%、(44.013±1.267)%]顯著下降(P<0.01)，而高脂+FUNDC1組存活率(68.150±0.655)%明顯高于(P<0.01)高脂組，高脂組和高脂+空載組兩組結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見圖2。

與對(duì)照組比較，**P<0.01；與高脂組比較，##P<0.01

2.3 各組細(xì)胞活性氧含量

與對(duì)照組相比，高脂組和高脂+空載組熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.01)，表明ROS含量明顯升高，而高脂+FUNDC1組熒光強(qiáng)度明顯低于(P<0.01)高脂組，表明高脂+FUNDC1組ROS含量減少，高脂組和高脂+空載組兩組結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表1、圖3(封二)。

表1 各組線粒體內(nèi)ROS水平及膜電位去極化比例

2.4 各組細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)情況

與對(duì)照組相比，高脂組和高脂+空載組探針綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱，紅色熒光與綠色熒光強(qiáng)度比值顯著降低(P<0.01)，提示線粒體膜電位去極化的比例升高，而高脂+FUNDC1組與高脂組相比，JC-1 探針綠色熒光強(qiáng)度顯著減弱，紅色熒光強(qiáng)度增加，紅色熒光與綠色熒光比值明顯增高(P<0.01)，線粒體膜電位去極化的比例減少，高脂組和高脂+空載組兩組結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表1、圖4(封二)。

2.5 各組細(xì)胞ATP含量情況

與對(duì)照組相比，高脂組和高脂+空載組ATP含量[(62.054±11.26)μmol/gprot、(57.604±9.696)μmol/gprot]顯著下降(P<0.01)，而高脂+FUNDC1組ATP含量(117.446±21.695)μmol/gprot明顯高于高脂組(P<0.05)，高脂組和高脂+空載組兩組結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。

2.6 FUNDC1轉(zhuǎn)染效率及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

轉(zhuǎn)染48h后，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染FUNDC1組FUNDC1量顯著上升(P<0.01)，經(jīng)Image J軟件分析蛋白條帶可得，轉(zhuǎn)染效率達(dá)192.49%。結(jié)果見圖5。

與對(duì)照組比較，**P<0.01

與對(duì)照組相比，高脂組和高脂+空載組LC3b/a增加(P<0.01)，P62含量增加(P<0.05)，F(xiàn)UNDC1變化無顯著差異(P>0.05)；與高脂組相比，高脂+FUNDC1組FUNDC1、LC3b/a、P62明顯減少(P<0.05)。高脂組和高脂+空載組兩組結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見圖6。

A：各組細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)情況(n=3，±s) 1：對(duì)照組；2：高脂組；3：高脂+空載組；4：高脂+FUNDC1組

3 討 論

高脂血癥嚴(yán)重影響患者健康，是動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、胰腺炎、冠心病及腦梗死等疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]。高脂血癥所導(dǎo)致的脂毒性作用對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷主要在于誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體產(chǎn)生過量ROS，有研究表明[10]，過量ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激會(huì)損傷組織與細(xì)胞，致使其功能障礙、代謝紊亂。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)將導(dǎo)致血管生理功能紊亂，是高脂血癥誘發(fā)動(dòng)脈硬化的原因之一。

FUNDC1是一個(gè)定位于線粒體外膜上的線粒體自噬的受體蛋白[11]，在FUNDC1過表達(dá)的情況下能夠引起顯著的線粒體自噬[12]。線粒體自噬是一種選擇性清除功能失調(diào)線粒體的細(xì)胞自我修復(fù)過程[13]。其調(diào)節(jié)線粒體的數(shù)目和質(zhì)量，對(duì)減少ROS產(chǎn)生、調(diào)節(jié)代謝平衡、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有著重要的意義。有研究[14]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UNDC1在心臟健康的維持中有重要意義，它促進(jìn)線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聯(lián)結(jié)處的穩(wěn)定，對(duì)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細(xì)胞整體的穩(wěn)態(tài)有重要作用。FUNDC1匱乏的心肌細(xì)胞中，F(xiàn)UNDC1-環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)途徑調(diào)節(jié)失衡，線粒體發(fā)生損傷、功能紊亂。Wu等[15]發(fā)現(xiàn)代謝類疾病中線粒體的功能失調(diào)與自噬受體FUNDC1缺陷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)有關(guān)。Yu等[16]在研究Mst1在心臟缺血再灌注損傷中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，損傷機(jī)制之一是Mst1抑制了FUNDC1介導(dǎo)的自噬。

上述研究說明了FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能穩(wěn)定上有重要作用。而FUNDC1在高脂損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用還未見報(bào)道，本研究利用腺病毒為載體過表達(dá)EA.hy926人血管內(nèi)皮細(xì)胞中FUNDC1，再以0.2mmol/L PA處理轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞，檢測(cè)其增殖活力、ROS含量變化、線粒體膜電位去極化情況、ATP生成量和自噬相關(guān)蛋白變化等指標(biāo)來探究FUNDC1在高脂損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，高脂組和高脂+空載組LC3、P62含量明顯增加(P<0.05)；高脂+FUNDC1組相比較于高脂組LC3、P62含量明顯減少(P<0.05)，高脂組和高脂+空載組結(jié)果無明顯差異(P>0.05)。LC3蛋白分為L(zhǎng)C3-a和LC3-b兩種形式，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3-a與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3-b，聚集在自噬體表面，LC3-a向LC3-b的轉(zhuǎn)化意味著自噬體的形成，LC3-b與LC3-a的比值是反映細(xì)胞自噬程度的標(biāo)志之一。P62蛋白是自噬體與底物之間的適配蛋白，它與泛素化蛋白結(jié)合后，與LC3相互作用聚集在自噬體上，并不斷被自噬體-溶酶體降解。P62蛋白水平高低反映自噬活性的高低，當(dāng)自噬功能減弱時(shí)，P62會(huì)不斷積累。Western Bolt檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在高脂組中，高脂損傷會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生反饋調(diào)節(jié)，高脂組LC3-b增多，表示在內(nèi)皮細(xì)胞中自噬小體生成量不斷增多，但結(jié)合P62蛋白增多的結(jié)果來看，生成的自噬小體沒有被溶酶體降解，即高脂組自噬反應(yīng)沒有發(fā)生完全。在過表達(dá)FUNDC1的高脂+FUNDC1組中，LC3-b、P62含量明顯減少，Western Bolt檢測(cè)FUNDC1腺病毒轉(zhuǎn)染效率的實(shí)驗(yàn)中可得，F(xiàn)UNDC1過表達(dá)效率達(dá)到192.49%，而在高脂+FUNDC1組中，發(fā)現(xiàn)FUNDC1的量是減少的，參考FUNDC1作用機(jī)制，即FUNDC1與LC3-b蛋白相互結(jié)合作用[7-8]，表明在高脂+FUNDC1中，過表達(dá)的FUNDC1與LC3-b相結(jié)合發(fā)揮介導(dǎo)自噬的作用，再結(jié)合P62蛋白減少的結(jié)果，表明生成的自噬小體已被溶酶體降解，即高脂+FUNDC1組自噬反應(yīng)進(jìn)行的更加完全，在高脂損傷的內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)FUNDC1有促進(jìn)自噬反應(yīng)進(jìn)行的作用。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂+FUNDC1組相比較于高脂組，細(xì)胞活力明顯提升(P<0.01)；ROS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂+FUNDC1組相比較于高脂組，綠色熒光明顯減弱(P<0.01)，說明ROS含量下降；線粒體膜電位(JC-1)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂+FUNDC1組相比較于高脂組，紅色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱，紅色熒光與綠色熒光強(qiáng)度比值顯著升高(P<0.01)，提示線粒體膜電位去極化的比例降低；ATP含量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂+FUNDC1組相比較于高脂組，ATP含量有所增加(P<0.05)。與高脂組相比較，過表達(dá)FUNDC1的高脂+FUNDC1組上述各項(xiàng)細(xì)胞功能指標(biāo)均得到一定程度改善。

綜上所述，過表達(dá)FUNDC1對(duì)高脂誘導(dǎo)的EA.hy926人血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，其具體機(jī)制可能與促進(jìn)自噬發(fā)生，降低ROS量，改善線粒體功能障礙有關(guān)。