陳祖靜,高尚坤,陳 園,何平會,何 茜,邱 權,李吉躍,*

1 華南農業(yè)大學林學與風景園林學院,廣州 510642 2 廣東省森林植物種質創(chuàng)新與利用重點實驗室,廣州 510642

施肥顯著影響土壤中碳(carbon, C)、氮(nitrogen, N)、磷(phosphorous, P)庫和C/N/P比值及土壤微生物量,對生態(tài)系統的生物地球化學過程產生較大影響[1-2]。土壤微生物是連接生態(tài)系統地下和地上部分的紐帶,其對施肥的響應有不同觀點[3]。一些研究認為土壤微生物對施肥很敏感[4]。另一些研究則報道,微生物對肥的添加響應不明顯[5]。目前,相關研究主要聚焦在土壤理化性質、微生物量或酶等對施肥的響應,這些指標較難全面反應土壤微生物的整體響應特征[6-8]。

土壤微生物群落結構是土壤質量的重要指標之一,比土壤理化性質更能準確反映土壤質量,能更有效的響應土壤質量變化,如體現土壤是否退化或有所改良[9-10]。首先,土壤微生物群落組成結構因植被類型、土壤類型、管理措施和肥料類型等的不同而異[11-13]。其次,由于土壤微生物具有功能冗余,其功能類群更能夠有效的響應外界環(huán)境的變化[14]。施肥能夠改變土壤的理化性質,改善土壤養(yǎng)分有效性,從而影響土壤微生物結構及功能類群,對提高植物生產力具有重要的作用[15-16]。此外,真菌會與植物根系形成共生體,土壤養(yǎng)分富集一定程度上會促進菌根的生長,而當土壤養(yǎng)分貧瘠時,腐生真菌會率先降解土壤惰性有機質釋放養(yǎng)分[17-18]。研究表明,土壤真菌對養(yǎng)分和管理措施等影響較為敏感,比細菌對土壤環(huán)境的變化更加敏感[19]。此外,真菌通過分解土壤有機質為植物提供有效養(yǎng)分,促進土壤團聚體形成而改善土壤結構,參與土壤物質轉化、養(yǎng)分循環(huán)和能量轉化[20]。但目前關于施肥對土壤真菌群落影響的研究還較少。

近年來,隨著高通量測序技術的不斷發(fā)展及FUNGuild等預測分析真菌功能平臺的開發(fā)和優(yōu)化,越來越多學者開始關注真菌群落結構特征及功能的變化,以及其對植物生長發(fā)育的影響[13,21]。桉樹是南亞熱帶地區(qū)最重要的人工林樹種之一,具有巨大的經濟和生態(tài)價值[22]。作為速生段輪伐期樹種的代表,施肥是目前提高桉樹人工林生產力最直接有效的方法,但短期施肥是否能有效影響土壤質量,土壤真菌群落特征是如何響應施肥措施等問題還不清楚,限制了桉樹人工林土壤質量的有效調控。因此,本研究以桉樹人工林土壤為研究對象,通過高通量測序技術和FUNGuild平臺,探索桉樹土壤真菌群落組成結構及其功能類群對短期施肥措施的響應特征,以及導致土壤真菌群落差異的影響因子,將有助于對桉樹人工林土壤質量進行評價和改善,為桉樹人工林的科學施肥及可持續(xù)生產提供參考依據。

1 試驗地概況

試驗樣地位于廣東省廣州市增城區(qū)華南農業(yè)大學教學科研基地(23°14′48 N, 113°38′20 E),屬于南亞熱帶季風氣候,雨量充沛,年平均氣溫為21.91℃,年均降水量為2004.5 mm。土壤類型為典型的赤紅壤。

供試桉樹為尾巨桉(Eucalyptusurophylla×E.grandis)DH32-29無性系健康苗,苗高為20—35 cm,地徑為0.15—0.20 cm。2017年4月全墾整地后使用寬行窄株種植,密度為3 m× 2 m,1650株/hm2。對照組(不施肥處理,control, CK)和水肥一體化施肥(施肥處理,fertilization, F)組分別設置5個(共189株)和4個(共186株)小區(qū),CK與施肥處理間用5 mm厚的聚丙烯板隔開,深度為60 cm,以確保處理間土壤無肥料交換干擾和減少滴管施肥處理對相鄰區(qū)處理造成的影響。施肥處理參照我國桉樹生產中的標準施肥量,穴施基肥24 g 尿素, 72 g 五氧化二磷, 24 g 氧化鉀,每公頃40 kg。2017年8月開始使用水肥一體化技術,分別按每株10.28 g尿素、67.11 g磷酸二氫銨、16.24 g氯化鉀、1.06 g四硼酸鈉、0.26 g硫酸鋅溶于水后進行滴灌追肥,滴速為4 L/h,每周2次,每次連續(xù)3 h,每周共處理8 h,共處理6個月。

2 研究方法

2.1 樣品采集

2018年1月在每個小區(qū)采用對角線多點隨機采集表層(0—15 cm)土壤,每個小區(qū)隨機選取8個點,除去枯枝落葉層,用內徑為5 cm的土鉆采集土樣,各小區(qū)內所有土芯分別充分混合,并去除樹根和石子等雜物,置于自封袋內保存。每小區(qū)樣品分為2部分,一部分立即用液氮冷卻帶回實驗室置于-80℃保存,用于DNA提??；另一部分帶回實驗室后立即測定含水量,其余樣品自然風干并過2 mm篩后用于相關理化性質分析。

2.2 土壤理化性質測定

土壤pH值采用1∶2.5(m/v)土水比,用酸度計( PHS-3E,雷磁,中國)測定；全氮和土壤有機碳使用C/N測定儀(IsoPrime100, Isoprime)；全磷含量采用濃硫酸-高氯酸消煮-鉬銻抗比色法,速效磷采用鹽酸-氟化銨溶液浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀采用醋酸銨浸提-火焰光度計測定(ICP-MS, 7700x, Agilent)。微生物碳MBC(mg/kg)采用氯仿熏蒸浸提法。

2.3 DNA提取和Illumina測序

土壤微生物總DNA采用PowerSoil kit (MoBio Laboratories Carlsbad, CA, USA)試劑盒提取。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性,NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific, USA)檢測DNA濃度和質量。利用真菌18S引物SSU0817 (5′-barcode-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)和SSU1196R (5′-barcode-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′) 進行聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR) 擴增。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物質量,利用試劑盒AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA,USA) 對PCR產物進行純化,構建文庫并通過IlluminaMiSeq平臺,2×250 bp的雙端測序策略對文庫進行測序(美吉生物公司,上海)。

2.4 序列分析和真菌鑒定

測序數據進行拼接和質控,去除低質量序列,使用QIIME (Quantitative Insights into Microbial Ecology) 1.7.0-devpipeline ( http: / /www.qiime.org) 進行分析,序列間97%以上的相似性歸并到一個分類單元(Operational taxonomic units,OTU)中,并用核糖體數據庫(Ribosomal Database Project,RDP)(http://rdp.cme.msu.edu/)進行歸并,獲得分類操作單元OTU。通過比對UNITE數據庫(https://unite.ut.ee/)進行物種信息比對,鑒定真菌群落,獲得每條OTU序列在界、門、綱、目、科、屬、種分類水平上的分組信息。

2.5 真菌功能類群FUNGuild分析

真菌的營養(yǎng)類型及其功能類群分類利用工具FUNGuild v1.0,步驟為將QIMME pepline輸出的OTU信息合并,物種信息附加在OTU表格中,上傳至FUNGuild ( http: //www.stbates.org /guilds /app.php) 平臺進行比對分析,輸出結果包含了物種的分類單位(Taxon)、物種分類級別(Taxon Level)、營養(yǎng)型(Trophic Mode)、功能分組“Guild”和可信度“Confidence”等信息。為了不過度解讀真菌功能群,只保留置信度“極可能” (highly probable) 和“很可能” (probable)兩個等級[21]。

2.6 數據處理與分析

OTUs數、相對豐度、α和β多樣性、主坐標分析(Principal coordinate analysis,PCoA)和Adonis非參數檢驗等使用R語言(3.4.3、3.1.0)進行計算。數據差異顯著性統計分析采用SPSS 21.0 (Chicago, USA) 軟件,施肥與對照處理的土壤理化性質、多樣性指數、真菌群落及功能的差異采用方差分析(One-way ANOVA)。土壤真菌群落結構與土壤理化性質之間的相關關系采用冗余分析(Redundancy analysis,RDA)。同時,利用GraphPad Prism 6.0 軟件進行繪圖。

3 結果與分析

3.1 施肥對土壤因子的影響

土壤酸堿度、含水量、氮磷鉀含量等是影響微生物生長的重要因子。桉樹土壤因子對施肥的響應如表1所示。與對照處理相比,施肥極顯著降低了土壤的含水量和pH值,而土壤總氮、總磷和微生物碳含量顯著增加,速效磷、速效鉀和土壤有機碳含量極顯著增加,其中,施肥處理中速效磷和速效鉀含量分別是CK的21.45和1.50倍。說明施肥處理顯著提高了土壤肥力,但同時也導致土壤酸化和土壤含水量降低。

表1 施肥對土壤基本理化性質的影響

3.2 桉樹土壤真菌群落及其多樣性對施肥的響應

對測序結果進行比對,得到1150303條高質量序列,每個處理所測得的序列數約為39439—50187條。在97%的相似性水平下聚類共得到307個OTU,聚類為29門,51綱,79目,99科,109屬,145種,CK與施肥處理土壤真菌共有OTU為236個。施肥對桉樹土壤真菌群落組成及其相對豐度在門和目水平的影響表明,桉樹土壤微生物的優(yōu)勢真菌為擔子菌門Basidiomycota(48.61%—46.74%)和子囊菌門Ascomycota(39.31%—38.08%),優(yōu)勢門在施肥處理中占比略低于CK處理,但處理間差異不顯著(P>0.05)(表2)。從目水平上看,桉樹土壤優(yōu)勢真菌為散囊菌、古根菌、肉座菌、糞殼菌、柔膜菌、爪甲團囊菌、銀耳菌和牛肝菌。不同真菌的相對豐度對施肥處理的響應不同,牛肝菌目和散囊菌目和在施肥處理中(23.73%和19.95%)的優(yōu)勢地位顯著高于CK處理中,分別為CK的7.65和1.72倍,施肥處理中古根菌目、爪甲團囊菌目、銀耳菌目等其他優(yōu)勢菌目的相對豐度則低于CK處理。此外,其他已鑒定的種群含量在施肥處理后均有所變化,但相對豐度低于1%(未列出)。因此,桉樹土壤的優(yōu)勢真菌群落對施肥的響應在門水平沒有發(fā)生顯著變化,而在更高分辨率的目水平上,真菌群落呈現不同的響應特征(表2)。

表2 施肥處理桉樹土壤門和目水平真菌群落組成和相對豐度/%

OTUs水平的真菌群落α多樣性結果表明,施肥處理后桉樹土壤真菌群落的Shannon指數(2.77±0.14)和豐富度指數Ace(232.35±23.27)、Chao1值(228.61±19.94)均降低,而表示群落內優(yōu)勢種地位和作用的Simpson指數有所升高,但不同處理間差異不顯著(表3)。進一步基于樣本OTU水平的相異系數bray-curtis距離矩陣進行主坐標分析表明,施肥處理的真菌群落結構與CK顯著分開,第一主成分解釋了群落結構差異的88.76%,第二主成分解釋了群落結構差異的7.58%,共同解釋了群落結構差異的96.34%。此外,Adonis非參數檢驗表明施肥與對照處理間真菌群落結構差異極顯著(P<0.01)(圖1)。

表3 施肥對土壤真菌α多樣性指數的影響

圖1 桉樹土壤真菌群落組成的主坐標分析 Fig.1 Principal coordinate analysis (PCoA) of Eucalyptus soil fungal communities

3.3 真菌群落功能類群對施肥的響應

利用FUNGuild數據庫對施肥與CK組真菌群落進行比對。結果如圖2所示,CK組真菌的營養(yǎng)型以腐生型(Saprotroph)為主(46.23%),病理型(23.54%)次之,其他類型和共生型分別占20.52%和9.07%。而施肥處理后,真菌的營養(yǎng)型則以共生型為主,相對豐度為37.97%,是CK的4.19倍,其次為腐生型(37.54%)和病理型(13.23%),其他類型僅占11.26%。表明施肥極顯著改變了土壤真菌群落的營養(yǎng)類型,共生型真菌群落占比極顯著增加,而其他營養(yǎng)類型的真菌群落極顯著降低(P<0.01)。

圖2 施肥對土壤真菌營養(yǎng)類型的影響Fig.2 Effects of fertilization on soil fungi trophic mode “**”代表處理間差異極顯著

桉樹土壤真菌群落主要鑒定為土壤腐生真菌、木質腐生真菌、其他腐生真菌、未定義腐生真菌、叢枝菌根真菌、外生菌根真菌,內生真菌、內生寄生菌、動物病原菌和植物病原菌10個主要功能群(圖3)。其中,未定義腐生真菌在CK中占比最高,相對豐度為29.83%,其次為內生-寄生真菌(22.63%)和未定義真菌(20.59%),外生真菌占7.31%。而施肥處理中外生菌根真菌占比最高,達到36.88%,其次為未定義腐生真菌(32.82%)和內寄生真菌(12.74%),未定義真菌占11.26%(圖3)。進一步分析表明,共生真菌的優(yōu)勢屬為馬勃菌和球囊菌,其中馬勃菌施肥后占比(36.52%)極顯著增加,是CK的5.03倍,而其他共生真菌如球囊菌占比有所減少(未列出)。表明施肥顯著增加了桉樹土壤共生真菌中外生菌根真菌(尤其是馬勃菌)和木質腐生真菌的富集,而降低了土壤腐生真菌、動物病原菌和植物病原菌等的相對豐度。

3.4 真菌群落結構變化與土壤因子的關系

進一步通過冗余分析研究土壤真菌群落變化與土壤理化性質的關系。如圖4所示,土壤因子基本完全解釋了(96.32%)真菌群落差異,第一軸土壤因子解釋了真菌群落差異的88.61%,第二坐標軸土壤因子解釋了真菌群落差異的7.71%。群落結構差異與有效磷(P<0.01)、土壤含水量(P<0.01)、有效鉀(P<0.01),pH(P<0.05)呈顯著關系,土壤含水量(r=-0.947)和pH值(r=-0.936)與施肥呈負相關,而土壤有效磷(r=0.998)、SOC(r=0.992)、總氮(r=0.991)、速效鉀(r=0.987)、MBC(r=0.974)和總磷(r=0.804)含量與施肥呈正相關。說明施肥改善了土壤質量,但可能導致一定的酸化和水分虧缺。

圖3 施肥對土壤真菌功能類群的影響Fig.3 Effects of fertilization on soil fungal functional groups (Guild) “*”代表處理間差異顯著

圖4 施肥處理土壤真菌群落組成與土壤理化因子的RDA分析 Fig.4 The redundancy analysis of soil fungal community composition with soil physicochemical factors under fertilization箭頭代表環(huán)境因子變量;M: 含水量moisture； MBC: 微生物碳microbial biomass carbon; SOC: 土壤有機碳soil organic carbon; TN: 總氮 total nitrogen; TP: 總磷total phosphorus; AP: 速效磷available phosphorus; AK：速效鉀available potassium

4 討論

4.1 施肥對土壤真菌結構和功能群落的影響

土壤微生物對環(huán)境因子變化的響應極其敏感[20]。不同的微生物類群呈現不同生態(tài)學功能,且不同分類學水平上的微生物類群對土壤質量的響應特征也不盡相同[23-24]。本結果中,桉樹人工林土壤以擔子菌門和子囊菌門主導,大多數子囊菌門和擔子菌門都是腐生型或者共生型的營養(yǎng)方式,這與大多數的研究結果一致[13,21]。通常當土壤養(yǎng)分富集時,有利于富營養(yǎng)菌群的生長,而當土壤養(yǎng)分貧瘠時寡營養(yǎng)菌群的豐度相對增加[17,18]。短期施肥后桉樹土壤中擔子菌門和子囊菌門與CK相比呈下降趨勢,但差異不顯著。而在目水平上,牛肝菌目和散囊菌目在施肥處理中的優(yōu)勢地位顯著高于CK處理中,分別為CK的7.65和1.72倍,施肥處理中古根菌目、爪甲團囊菌目、銀耳菌目等優(yōu)勢菌目的相對豐度則低于CK處理。這可能與不同真菌目類群對資源的需求不同有關,短期施肥處理中顯著增加的牛肝菌目和散囊菌目可能屬于富營養(yǎng)菌群,而古根菌目、爪甲團囊菌目、銀耳菌目可能是寡營養(yǎng)菌群(表2)。因此,更細的分類學水平能更準確的反映土壤真菌對短期施肥的響應特征。

本研究中,短期施肥使桉樹人工林真菌多樣性指數降低,處理間差異不顯著(表3)。關于施肥對真菌多樣性的研究結果不一致,這可能與施肥的種類有關,無機肥易導致土壤酸化,抑制真菌群落的生長,而有機肥不會導致土壤的酸化[25-26]。其次,與施肥強度也間接影響真菌群落結構變化,如氮肥富集抑制腐生菌而活化部分菌根真菌,高氮肥會降低微生物量,而較低氮肥導致根尖外生菌根豐度下降,使真菌群落組成隨氮肥梯度變化[27-28]。短期施肥后桉樹人工林土壤真菌的群落結構顯著改變(圖1),這與大多數的研究結果一致[29]。其可能原因為：首先,真菌通常率先進入動植物殘體,進行破碎化、腐殖質化,使得復雜的大分子有機質被降解為利于植物易于吸收的有效養(yǎng)分[29]；其次,真菌與植物形成共生體有效獲取植物所需的養(yǎng)分,植物同時也為真菌生長提供所需的能量,如本研究中,短期施肥處理桉樹人工林土壤中外生菌根真菌占比最高,且共生真菌馬勃菌在施肥處理中極顯著增加(圖3)[26]；此外,酸堿度變化會導致部分真菌群落休眠或者激發(fā),如本研究中的球囊菌(表1,圖3)[30]。因此,短期施肥顯著影響了不同生態(tài)學功能的真菌類群,腐生型的真菌較少通過降解復雜的有機質來釋放養(yǎng)分,而共生型的真菌豐度相反會升高,從而改善土壤質量。

4.2 真菌群落變化與土壤因子的關系

短期施肥后,桉樹土壤總氮、總磷、有效磷、速效鉀含量顯著增加(表1),真菌群落對施肥產生顯著響應(圖1),土壤因子解釋了真菌群落結構差異的96.32%,說明施肥顯著提高了土壤肥力(圖4),這與前人研究結果一致[27]。土壤有機碳和MBC的含量是土壤健康的重要指標[8]。研究表明,添加氮磷鉀后,植物、土壤和微生物生物量C、N、P庫影響顯著增加[2,8]。增加氮的投入會減少微生物量,但旱地作物土壤中的微生物往往受益于礦物肥料的投入,礦質肥料的添加顯著增加水稻土壤微生物碳和有機碳含量[26]。本研究中,施肥增加了土壤微生物總量,提高了土壤碳的固定,土壤真菌群落變化對施肥的響應與MBC和SOC呈正相關(表1,圖4)。施肥促進植物生產力提高可能導致有機C的投入增加,進而增加MBC的含量[8]。此外,pH也是主導土壤微生物群落結構的主要限制因子,土壤酸堿度會導致部分類群進入休眠狀態(tài)[30]。桉樹土壤真菌群落變化對施肥的響應與pH和土壤含水量呈負相關,表明施肥導致了土壤酸化和土壤含水量減低(表1,圖4)。總之,施肥有效的改善了土壤的質量,也同時導致部分酸化,土壤環(huán)境因子能有效的解釋微生物群落的差異,土壤養(yǎng)分和土壤pH受到施肥顯著影響,從而影響土壤真菌群落特征。

本研究在一定范圍揭示了桉樹人工林土壤真菌結構和功能類群對短期施肥的響應及與土壤理化性質的關系。然而,土壤是個復雜的系統,土壤中其他微生物如細菌、土壤其他理化因子及相關酶是如何響應長期施肥處理等問題還有待進一步研究。此外,FUNGuild數據庫是基于目前已有的數據和文獻資料進行的,目前相關應用還較少,其數據庫還有待完善,同時也需要開發(fā)其他分析方法以更好的研究真菌所行使的功能。

5 結論

桉樹土壤真菌主要由擔子菌門和子囊菌門構成,短期施肥顯著改變了真菌群落結構,更細分類學水平能夠更加準確的反映不同類群對施肥的響應特征；其次,功能類群相對于群落結構對短期施肥的響應更加敏感,不同生態(tài)學功能群的響應不同,短期施肥使優(yōu)勢共生型真菌尤其是外生菌根真菌相對豐度顯著增加；此外,土壤有效養(yǎng)分含量、土壤含水量、pH值是影響真菌群落變化的主要原因。因此,合理施肥能有效改善土壤質量,從而提高地上植物的生產力。