利用腐生線蟲加速替代疫木中松材線蟲種群數(shù)量研究

王 磊，葉建仁，史麗娜

(南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

松材線蟲病是由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起的一種危險性森林病害，在我國鄉(xiāng)土松種上是一種典型的病原主導(dǎo)性病害，大多數(shù)寄主植物一旦感病很快枯萎死亡[1-2]。1982年在南京首次發(fā)生后，已經(jīng)陸續(xù)在我國19個省市傳播和蔓延[3]。由于我國松樹種類多、面積大且分布廣，森林資源和生態(tài)環(huán)境遭受了巨大的破壞，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)千億元[4-6]。

防控松材線蟲病主要有檢疫和疫情監(jiān)測、疫木除治、媒介昆蟲防治等。松材線蟲病一旦被檢疫或監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，疫木除治就成為防控的核心措施。此時病原線蟲和媒介昆蟲都集中在疫木中，只要徹底殺滅疫木中的天牛和線蟲，病害就可以得到防控[6]。2018年以前，帶有松材線蟲或松褐天牛(松墨天牛，Monochamusalternatus)的松樹砍伐后的處理手段有焚燒、熏蒸、熱處理、微波處理、切片、制板等[7-9]。由于這些疫木處理措施監(jiān)管漏洞多，一些實際未經(jīng)處理的疫木常被人為傳播到遠(yuǎn)近不等的地區(qū)，引發(fā)病害在更多的區(qū)域發(fā)生與蔓延[10]。2018年后國家進(jìn)一步嚴(yán)格疫木處理，要求病死樹必須在山上或山下就近就地盡快粉碎處理或燒毀[11]。此要求可有效減少疫木處理過程中的管控漏洞，但實際防控過程中出現(xiàn)了人力、財力、實際操作難以落實的狀況。我國南北森林環(huán)境變化大，許多情況下機(jī)械或人力作用有限。因此，研究探索簡易有效的松材線蟲病疫木就地除害技術(shù)對于控制我國松材線蟲病的蔓延擴(kuò)散意義重大。

在松材線蟲病疫木中除了松材線蟲，往往還存在其他寄生性植物線蟲、食真菌線蟲和食腐性線蟲。由于生存空間、食物競爭、釋放抗生類物質(zhì)等因素，線蟲在種群間會發(fā)生爭奪資源、產(chǎn)生競爭，抑制其他種群生長發(fā)育的現(xiàn)象[12-15]。腐生線蟲是一類以細(xì)菌作用的糖和蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物為食料的線蟲，不含口針但能靠取食腐殖質(zhì)或某些微生物進(jìn)行生長發(fā)育[16-17]。國內(nèi)外只有個別學(xué)者對枯死松樹體內(nèi)的腐生線蟲進(jìn)行過初步研究，松材線蟲病疫木在發(fā)病后期，通常會出現(xiàn)松材線蟲數(shù)量不斷減少，腐生線蟲數(shù)量不斷增加的現(xiàn)象[18-19]。雖然松材線蟲病往往發(fā)生在冬季，腐生線蟲的生長繁殖可能會受低溫限制難以應(yīng)用到實際生產(chǎn)上，但已有研究發(fā)現(xiàn)在自然條件下腐生線蟲仍會對松材線蟲具有一定抑制作用[20]?；诖?，本研究進(jìn)一步探討不同種類腐生線蟲對病疫木中松材線蟲種群數(shù)量的影響，旨在篩選出能夠加速松材線蟲種群消亡的腐生線蟲種類，探索利用高效的腐生線蟲替代技術(shù)就地處理松材線蟲病疫木，從源頭阻斷松材線蟲病的傳播與擴(kuò)散。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分離腐生線蟲的疫木來自國內(nèi)5個發(fā)生松材線蟲病的疫區(qū)，分別是安徽省池州市九華山風(fēng)景區(qū)(117°8′E，30°5′N)、黃山市黃山風(fēng)景區(qū)(118°1′E，30°1′N)，四川省巴中市巴州區(qū)水寧寺鎮(zhèn)(107°1′E，31°49′N)，江蘇省南京市中山陵(118°51′E，32°04′N)、宿遷市宿城區(qū)(118°17′E，33°58′N)，均屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，四季分明、溫暖濕潤、雨量充沛、光照充足，霜期較短，冬季平均氣溫為0℃以上。在這些疫區(qū)染病死亡的黑松(Pinusthunbergii)和馬尾松(Pinusmassoniana)上采集木樣，用于腐生線蟲的分離。腐生線蟲替代松材線蟲試驗的疫木來自江蘇句容林場搖令口工區(qū)(119°12′E，32°05′N)當(dāng)年感染松材線蟲病的15年生黑松林。

1.2 試驗方法

1.2.1 腐生線蟲與松材線蟲的主要形態(tài)區(qū)別

在光學(xué)顯微鏡下觀察，腐生線蟲的口腔內(nèi)不含口針，松材線蟲的口腔內(nèi)含有口針；腐生線蟲的食道類型通常是小桿型或雙胃型，松材線蟲的食道類型是滑刃型。

1.2.2 腐生線蟲的純化培養(yǎng)

將漏斗放入滅菌鍋內(nèi)，105 ℃滅菌10 min后，取每份木樣的木質(zhì)部，劈成細(xì)木條，用貝爾曼漏斗法[21]靜置分離12 h后，再用15 mL離心管收集其濾液。在顯微鏡下觀察分離得到的線蟲液，用移液槍挑取25條以上形態(tài)相似的腐生線蟲成蟲，置于腐生線蟲培養(yǎng)基的平板上，25 ℃下培養(yǎng)14 d后再次用貝爾曼漏斗法收集線蟲，進(jìn)行純化培養(yǎng)。

腐生線蟲培養(yǎng)基配方：黑松木屑30 g、葡萄糖20 g、瓊脂30 g、水1 L，121 ℃滅菌25 min[22]。

1.2.3 腐生線蟲在培養(yǎng)基上的繁殖力測定

將每種腐生線蟲在腐生線蟲培養(yǎng)基平板上各接種3皿，每皿接種200條，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。采用貝爾曼漏斗法分離培養(yǎng)基中的腐生線蟲，在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)，最后統(tǒng)計各種腐生線蟲在培養(yǎng)基上的擴(kuò)增數(shù)量情況。

1.2.4 室內(nèi)條件下腐生線蟲與松材線蟲在疫木塊內(nèi)種群競爭試驗

將感病黑松主干均勻切割成3.5 cm厚的圓盤，從形態(tài)學(xué)上部開始由高到低依次對圓盤進(jìn)行編號，帶回南京林業(yè)大學(xué)森林病理實驗室。根據(jù)相鄰圓盤大小選擇3個圓盤，將圓盤邊材鋸成邊長2.5 cm的小木塊，每個圓盤選擇18個小木塊，將這54個小木塊作為每個溫度每種蟲株處理的接種樣品。由于松材線蟲數(shù)量在距離地面不同高度的圓盤的邊材之間差異較大，并且每一圓盤的邊材體積有限，為了盡量減少試驗誤差，對每一溫度每種蟲株都安排了相應(yīng)的對照組。將木塊分為9列，前3列為對照組，處理時間分別設(shè)置為0、15、30 d，后6列的處理時間分別為3個接種梯度的15、30 d，每列6個重復(fù)。

接種前先記錄木塊鮮質(zhì)量，然后用電鉆在木塊中央鉆取1個直徑0.5 cm、深1.0 cm的小孔，將滅菌的濕棉花置于接種孔底部，再在孔內(nèi)滴加無菌水和腐生線蟲懸浮液，滴加液體的總體積為600～700 μL，以對照組疫木塊中松材線蟲數(shù)量的平均值作為基礎(chǔ)值，將腐生線蟲按照1、2、4倍(接種體積分別為100、200、400 μL)于該基礎(chǔ)值數(shù)量接種至處理木塊中。接種腐生線蟲在濕棉花上后，立刻再用濕棉花覆蓋接種孔，并用封口膜包裹接種孔。本試驗共接種8種腐生線蟲，分別置15和25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15和30 d后，使用貝爾曼漏斗法分離線蟲并統(tǒng)計松材線蟲和腐生線蟲的數(shù)量。按如下公式計算木塊中松材線蟲減少率：

式中：x1表示試樣木塊的松材線蟲減少率，%；n0表示試樣木塊0 d時(對照組)的初始松材線蟲數(shù)量，條/g；n1表示試樣木塊在接種后15或30 d時的松材線蟲數(shù)量，條/g。

1.2.5 自然條件下腐生線蟲種群與松材線蟲種群間競爭試驗

于2019年12月在江蘇省句容林場進(jìn)行野外接種試驗。用油鋸將當(dāng)年染病的松材線蟲病疫木主干分成約75 cm長的木段并逐一編號。每個木段設(shè)置4個接種孔，每個孔深度為50 mm、直徑35 mm。將濕棉花置于每個孔的底部，將腐生線蟲懸浮液接種至棉花上，并在孔上方覆蓋一層濕棉花后用保鮮膜包裹住接種口。試驗設(shè)置8種腐生線蟲處理，每處理12個重復(fù)，每重復(fù)的接種量為2.0×105～2.5×105條，以接種無菌水的木段作為對照。2020年 4月，即120 d后取樣，每個木段設(shè)置5個取樣點，位于接種孔附近，用電鉆鉆取木屑，裝入信封帶回實驗室，使用貝爾曼漏斗法分離?；厥章┒穬?nèi)的木屑裝入信封，放入105 ℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定。在天牛羽化前，即150 d后，將木段分成兩部分。一部分用于收集天牛蛹室周圍0.5～1.0 cm木樣，另一部分用鐵絲網(wǎng)罩住，等待天牛羽化后捕獲天牛。蛹室周圍木樣和天牛均帶回實驗室使用貝爾曼漏斗法分離并統(tǒng)計線蟲數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用 Excel 2010和SPSS 24.0處理和分析數(shù)據(jù)，Prism 6.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫木中分離的腐生線蟲及在培養(yǎng)基中的繁殖速率

采用貝爾曼漏斗分離法，共分離到8種腐生線蟲，具體蟲株及其整體形態(tài)特征見圖1。

根據(jù)采樣疫區(qū)名稱將8種腐生線蟲分別編號為蟲株JHS1、JHS2、JHS4、HS2、ZSL1、SN1(♀)、SQ1(♀)、SQ3(♀)。腐生線蟲JHS1、JHS2、JHS4、HS2和ZSL1均含有雌雄蟲，雄蟲的體長均稍小于雌蟲。SN1、SQ1、SQ3均未發(fā)現(xiàn)有雄蟲，可能存在兩性同體生殖或孤雌生殖，即卵和精子都由同一母體產(chǎn)生，通過自體受精而繁殖；也可能存在性成熟的雄蟲在和雌蟲交配后很快死亡的情況，所以未檢出雄蟲。在具體形態(tài)上，腐生線蟲的后口腔壁上可能帶有2～3個疣突或桿狀的小齒；食道為小桿型或雙胃型，未見食道腺；尾部均為圓錐形，但尾型在不同種的蟲株間往往差異明顯；雌蟲的生殖腺單個或1對；雄蟲的尾部有的有交合傘，有的不具備，但都具備6～9對生殖乳突。腐生線蟲培養(yǎng)14 d的繁殖力情況見表1，由表1可知，在木屑培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)14 d時，蟲株SQ3和ZSL1的擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于其他處理組，分別為239.9和136.3倍；其次是蟲株HS2和SQ1，分別為52.9和34.8倍。而蟲株JHS1、JHS2、JHS4和SN1在培養(yǎng)基上的繁殖力情況表現(xiàn)都一般，擴(kuò)增倍數(shù)分別為12.5、11.7、10.5和17.3倍，相互之間不存在顯著差異?？梢?，木屑培養(yǎng)基適合多數(shù)腐生線蟲的前期快速擴(kuò)繁工作。

表1 腐生線蟲培養(yǎng)14 d的繁殖力情況

2.2 室內(nèi)條件下腐生線蟲與松材線蟲在疫木中的競爭

2.2.1 在15 ℃條件下腐生線蟲對松材線蟲的抑制作用

在15 ℃條件下培養(yǎng)15 和30 d后，8種腐生線蟲在不同接種量的疫木塊中均能被分離到。分析結(jié)果(圖2)表明，接種量越大的疫木塊中腐生線蟲初期定殖的密度就越大，但隨著時間延長8種腐生線蟲數(shù)量均逐漸降低，有的降低很快，有的降低到一定程度后又有上升。

其中蟲株ZSL1和JHS2在30 d時仍能保持較高的種群數(shù)量。而且發(fā)現(xiàn)在30 d時，接種量為400 μL 的蟲株JHS2處理與對照相比，松材線蟲種群數(shù)量顯著減少(P<0.05)，松材線蟲減少率為89.27%，與對照相比減少率提高19.05%；接種量為100 μL的蟲株JHS4處理組的木塊中松材線蟲減少率為90.93%，與對照相比提高14.08%(圖3)。而在蟲株SN1和SQ3處理中出現(xiàn)松材線蟲減少率為負(fù)值的情況，可能是由于這兩處理的接種木塊在取材時處于松材線蟲感染中后期，此時松材線蟲繁殖旺盛、具有明顯的種群優(yōu)勢。

2.2.2 在25 ℃條件下腐生線蟲對松材線蟲的抑制作用

在25 ℃條件下培養(yǎng)15 和30 d后，8種腐生線蟲在不同接種量下均能從木塊中分離得到，初期疫木中腐生線蟲數(shù)量也與接種量相關(guān)，但很快就逐漸減少，其中6種蟲株在30 d時，已經(jīng)降到很低的數(shù)量，只有蟲株SQ3和JHS4依然能夠保持一定種群數(shù)量(圖4)。

培養(yǎng)15 和30 d后，對木塊中松材線蟲的種群數(shù)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明(圖5)，25 ℃條件下培養(yǎng)15 和30 d后，與對照相比，在8個處理中蟲株JHS4表現(xiàn)最為突出(P<0.05)。在15 d時，蟲株JHS4處理組的3種不同接種量的木塊中松材線蟲減少率分別為75.30%、63.69% 和78.40%，均顯著高于對照組的39.88%(P<0.05)。在培養(yǎng)30 d時，接種量為400 μL的蟲株JHS4處理中松材線蟲減少率為44.05%，與對照相比差異顯著(P<0.05)。30 d時蟲株JHS4處理疫木塊中松材線蟲的數(shù)量與15 d時相比明顯增加，可能是因為前15天時間內(nèi)蟲株JHS4在疫木塊中的存活數(shù)量相對較多，能顯著抑制松材線蟲生長繁殖，后15天內(nèi)蟲株JHS4在疫木塊中的種群數(shù)量雖然還保持在一定水平，但總體數(shù)量已經(jīng)不如剛接種時的存活數(shù)量，所以對松材線蟲繁殖的抑制效果略有減弱。

2.3 野外條件下腐生線蟲與松材線蟲在疫木中的競爭

2.3.1 接種腐生線蟲對木段內(nèi)松材線蟲種群數(shù)量的影響

林間野外試驗結(jié)果(圖6)表明，接種試驗120 d后，所有處理組包括對照中松材線蟲的數(shù)量均在減少。但是，接種蟲株JHS1、JHS2、JHS4、HS2和SN1處理組的木段內(nèi)松材線蟲減少率均高于對照，其中接種蟲株JHS4的木段內(nèi)松材線蟲的減少率為96%，與對照(74%)相比差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 接種腐生線蟲對羽化天牛及其蛹室周圍攜帶松材線蟲數(shù)量的影響

從2020年5月底到7月初，從林間放置的網(wǎng)罩中抓取羽化后的松褐天牛(松墨天牛)，分離攜帶的松材線蟲并統(tǒng)計數(shù)量，結(jié)果如表2所示。用不同的腐生線蟲處理木段后，羽化天牛攜帶的松材線蟲數(shù)量差異較大。對照組內(nèi)每頭天牛平均攜帶986條松材線蟲，在接種蟲株JHS4處理中天牛攜帶的松材線蟲數(shù)量最少，平均每頭天牛攜帶的松材線蟲數(shù)量為132條，為對照的13.39%。其次為蟲株ZSL1和JHS2處理，平均每頭天牛攜帶的松材線蟲數(shù)量分別為150和262條，為對照的15.21%和26.57%。

表2 接種不同腐生線蟲對羽化松褐天牛攜帶松材線蟲種群數(shù)量的影響

2020年5月上旬在天牛羽化前，收集天牛蛹室周圍的木樣, 分離其中松材線蟲數(shù)量。結(jié)果如表3所示。由表3可知，所有處理組蛹室周圍木樣所攜帶的松材線蟲數(shù)量均低于對照。其中，接種蟲株JHS4處理組蛹室周圍木樣攜帶的松材線蟲數(shù)量最低，為20條/g，是對照的25.64%；其次為蟲株ZSL1處理組，攜帶松材線蟲的數(shù)量為24條/g，是對照的30.77%。在鏡檢時發(fā)現(xiàn)蟲株JHS2、JHS4、ZSL1、HS2和SQ3這5種腐生線蟲普遍存在于相應(yīng)處理組的蛹室中。

表3 接種不同腐生線蟲對天牛蛹室攜帶松材線蟲種群數(shù)量的影響

3 討 論

通過接種腐生線蟲至含有松材線蟲的病疫木中，在室內(nèi)及野外條件下進(jìn)行腐生線蟲與松材線蟲的種間競爭試驗，篩選能夠加速松材線蟲種群消亡的腐生線蟲蟲株。研究發(fā)現(xiàn)蟲株JHS2、JSH4、ZSL1可在不同的條件下抑制松材線蟲的種群數(shù)量，具有一定的生物防治應(yīng)用潛力。其中蟲株JSH2和JSH4在室內(nèi)及野外條件下對松材線蟲種群數(shù)量均有抑制作用；蟲株ZSL1僅在野外接種試驗中表現(xiàn)出了明顯抑制松材線蟲繁殖的效果，這可能與松材線蟲和接種的腐生線蟲種群間相互作用的時間長短有關(guān)。

生物防治是一種可持續(xù)性的防治方法，不僅可以在一定程度上替代化學(xué)農(nóng)藥，而且無殘毒，對環(huán)境沒有污染。除植物寄生線蟲外[23]，線蟲中有許多種類是農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)中的有效生物防治種[24-26]。本研究發(fā)現(xiàn)在環(huán)境溫度較低(15 ℃)時，蟲株JHS2在高接種量下可發(fā)揮對松材線蟲的抑制作用，而蟲株JSH4在低接種量下才可明顯抑制松材線蟲的種群數(shù)量，表明這兩種腐生線蟲發(fā)揮作用的有效接種量不同。Aalten[27]和Smitley等[28]分別使用小卷蛾斯氏線蟲(Steinernemacarpocapsae)和嗜菌異小桿線蟲(Heterorhabditisbacteriophora)抑制植物寄生線蟲生長繁殖的相關(guān)研究表明，線蟲種類不同，有效作用的施用量存在差異。溫度是影響線蟲生長發(fā)育的重要因子，低溫可能限制了腐生線蟲發(fā)揮競爭作用。史麗娜[20]使用腐生線蟲培養(yǎng)基接種腐生線蟲并置于不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明在15 ℃時，腐生線蟲能夠正常進(jìn)行生長繁殖，最適宜生長溫度范圍為20～25 ℃。本研究中在適生溫度 25 ℃的培養(yǎng)后期(30 d時)，僅高接種量的蟲株JHS4發(fā)揮了抑制效果，表明有效的抑制作用是由接種量和時間相互作用共同決定的。這種相互作用與PéREZ等[29-30]的研究結(jié)果相同。但蟲株JHS4的抑制效果是否隨著接種量的增加或時間的延長而提高還需要進(jìn)一步的研究。

松材線蟲傳播到一個新的區(qū)域，要能成功定殖、建群和擴(kuò)展，必須具備感病的寄主植物、攜帶線蟲的媒介昆蟲和適宜的環(huán)境條件[31-32]。天牛是松材線蟲病的傳播媒介，通過抑制媒介昆蟲攜帶線蟲的數(shù)量能夠在一定程度上減少松材線蟲病的發(fā)生。蒙海勤等[33]發(fā)現(xiàn)木腐真菌可阻斷松材線蟲向蛹室聚集。本研究結(jié)果表明腐生線蟲能減少天牛及其蛹室周圍的松材線蟲數(shù)量，這可能與疫木內(nèi)松材線蟲整體數(shù)量減少直接相關(guān)。綜上所述，松材線蟲病疫木中存在某些腐生線蟲種群能夠加快松材線蟲種群消亡的速度，將其應(yīng)用于松材線蟲病的疫木除治具有廣闊前景，值得進(jìn)一步深入開發(fā)研究。