劉軍莉,劉川川,李潤樂,劉慧慧,崔 森*

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院,青海西寧810001;2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院,青海 西寧810001)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種獲得性、進(jìn)行性認(rèn)知損害足以影響日常生活能力的神經(jīng)退行性病變,是導(dǎo)致癡呆的最主要的原因,占50%～75%[1]。AD的基本特征是淀粉樣斑塊(Aβ)和神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)[2],此外可見營養(yǎng)不良的神經(jīng)突起、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及小膠質(zhì)細(xì)胞的活化等[3]。近年來,雖然研究者們對AD的理解有了很大的提高,但具體機(jī)制仍無法完全闡明。普遍認(rèn)為,Aβ沉積引起神經(jīng)炎癥,導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,從而引發(fā)AD。由于AD起病緩慢、病程長、病因復(fù)雜,目前仍無確切的治療藥物和方法。有研究顯示,食用發(fā)酵乳制品,如酸奶和低脂奶酪,可能會降低老年人認(rèn)知能力下降的風(fēng)險(xiǎn),并有助于預(yù)防AD[4-6]。藏區(qū)酸奶是由青海藏區(qū)農(nóng)牧民沿用傳統(tǒng)方法手工制作的發(fā)酵食品,通常以鮮牛奶為原料,用天然乳酸菌作發(fā)酵劑,在37℃左右條件下發(fā)酵8～10 h。已有研究表明藏區(qū)牦牛酸奶具有抗氧化活性、降低膽固醇以及提高免疫力的作用[7]。在青藏高原,發(fā)酵乳是藏族人日常飲食的重要組成部分[8]。我們推測藏族人群AD患病率低除了與遺傳背景、生活習(xí)俗等有關(guān)以外,可能與長期進(jìn)食傳統(tǒng)手工發(fā)酵乳有關(guān)。本研究觀察長期給予藏區(qū)發(fā)酵乳對阿爾茨海默病模型小鼠認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

兩月齡SPF級雄性B6C3系A(chǔ)PP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠,體重(20.03±3.52)g;兩月齡SPF級雄性B6C3系野生型小鼠,體重(19.86±3.37)g,均購于江蘇集箤藥康生物有限公司[許可證號：SCXK(蘇)2018-0008]。置于SPF級動物房中單籠飼養(yǎng),自由攝食(水)。本實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照國家《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例(GB14923-2010)》執(zhí)行。所有動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)青海大學(xué)動物保護(hù)與研究倫理委員會審核和批準(zhǔn)。

1.1.2 菌種與發(fā)酵乳

L.helveticus(CCTCC AB 2010205)購自中國微生物保藏管理中心。藏區(qū)發(fā)酵乳樣品來自青海省海南藏族自治州(海拔3200米)手工制作發(fā)酵乳的牧民家庭。用無菌吸管分多次吸取60～100 mL樣品裝入無菌的玻璃瓶中并以塑料薄膜密封,用低溫儲藏箱帶回實(shí)驗(yàn)室,使用20%甘油保存于-80℃冰箱中備用。

1.1.3 主要儀器和試劑

MRS購自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物工程有限公司;免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司;Aβ、TLR4、Myd88、NF-κBp65 蛋白抗體均購自英國艾博抗公司;Aβ1-42酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自武漢伊萊特生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 藏區(qū)發(fā)酵乳制備

在無菌條件下,按照傳統(tǒng)發(fā)酵流程標(biāo)化發(fā)酵過程：將牛奶煮沸5 min滅菌,冷卻至37℃,與樣品(發(fā)酵前的酸奶)混合,攪拌均勻,快速發(fā)酵。整個(gè)過程持續(xù)12 h,其間溫度維持在42℃。

1.2.2 菌落數(shù)計(jì)算

發(fā)酵完成后將發(fā)酵乳接種在MRS培養(yǎng)基中,在37℃厭氧培養(yǎng)箱倒置48 h,采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)[14]：取發(fā)酵乳樣品(0.5mL)放入0.85%生理鹽水中,搖勻拌勻。充分混勻后制成1：100的稀釋液,如此遞增直至稀釋到1：10-7。分別吸取三個(gè)稀釋度(10-5,10-6,10-7)的樣品稀釋液1 mL于MRS瓊脂培養(yǎng)平皿內(nèi)均勻涂布,每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行平皿,同時(shí)做PBS緩沖液的空白對照。在37℃厭氧培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h。選擇符合益生菌菌落特征、菌落數(shù)在40～300之間的平板按照GB/T 4789.35-2003規(guī)范要求計(jì)數(shù)菌落。

1.2.3 分組與干預(yù)

將APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為三組：(1)轉(zhuǎn)基因模型對照組(APP/PS1組;n=12;不進(jìn)行飲食干預(yù),給予生理鹽水);(2)乳酸桿菌組〔Lac.組;n=12;用瑞士乳桿菌(L.helveticus,Lac.)灌胃〕;(3)藏區(qū)發(fā)酵乳組(Yogurt組;n=12;用藏區(qū)發(fā)酵乳灌胃)。野生組(WT組;n=12;用生理鹽水灌胃)。L.helveticus及藏區(qū)發(fā)酵乳灌胃劑量根據(jù)以往的文獻(xiàn)[9-11]設(shè)定。這些文獻(xiàn)結(jié)果顯示,補(bǔ)充益生菌,劑量為10mL/kg/d時(shí)可以改善小鼠的記憶。此外,為了確保各組干預(yù)小鼠獲得活菌,我們每天上午9點(diǎn)通過灌胃進(jìn)行飲食干預(yù),持續(xù)20 w。

1.2.4 水迷宮實(shí)驗(yàn)(MWM)

在灌胃20 w后,使用水迷宮實(shí)驗(yàn)(包括定位航行和空間探索)評估各組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力[12]。實(shí)驗(yàn)使用圓形不透明水池〔直徑130cm;高度30cm,水溫(21±1)℃〕,水池等分4個(gè)象限,圓形平臺(直徑6cm)置于象限中央(隱藏在水面下1cm處)。從4個(gè)象限中點(diǎn)面向池壁將小鼠放入水中訓(xùn)練1～3 d,測試時(shí)設(shè)定第III象限為目標(biāo)象限,每次訓(xùn)練60 s,若60 s未找到平臺,將小鼠引導(dǎo)至第III象限平臺站立15 s,記錄潛伏期為60 s;第四天撤去平臺將小鼠從第III象限放入水池,記錄其60 s內(nèi)在目標(biāo)象限停留的時(shí)間及穿越平臺的次數(shù)。

1.2.5 小鼠血清Aβ水平檢測

從眼眶取血分離血清,根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行試驗(yàn),在450 nm波長處測定光密度值(OD值),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清Aβ1-42濃度(pg/mL)。

1.2.6 小鼠海馬Aβ蛋白表達(dá)檢測

每組取3只小鼠的海馬,常規(guī)制片后鏡檢觀察Aβ的蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度。陽性細(xì)胞呈黃色或棕黃色,主要分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)。采用BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像儀對切片進(jìn)行圖像采集,通過Motic Images Advanced3.2圖像分析軟件觀察100倍鏡下連續(xù)3個(gè)視野,測定各組小鼠海馬中顯示Aβ蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度的OD值。

1.2.7 小鼠 Aβ、TLR4、Myd88、NF-κBp65 檢測

取保存的小鼠右側(cè)海馬組織各30μg加 1 mL裂解緩沖液,研磨均勻后于冰上裂解30 min,離心(4℃,11000r/min)10 min,取上清液。按樣品與5×蛋白上樣緩沖液4：1的比例加入后煮沸10 min使其變性。定量后以30μg蛋白上樣行電泳。經(jīng)SDS-Page電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h 后,將膜與 Actin(1：2000)、Aβ (1： 1000)、 TLR4(1： 500)、 MyD88(1： 1000)、NF-κBp65(1：1000)一抗孵育(4℃)過夜。 經(jīng)洗滌后,與HRP標(biāo)記山羊抗小鼠(1：2000)、HRP標(biāo)記山羊抗兔(1：1000)二抗振蕩孵育(37℃)1 h。將NC膜放入熒光化學(xué)發(fā)光成像儀(ChemiQ4600)對條帶顯影并進(jìn)行灰度測定。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對藏區(qū)發(fā)酵乳平板菌落的計(jì)數(shù)

通過平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落數(shù)：10-5及10-6級因數(shù)量龐大無法計(jì)數(shù),10-7級計(jì)數(shù)結(jié)果為(4.48±0.35)×10-9。

2.2 藏區(qū)發(fā)酵乳對AD模型小鼠認(rèn)知功能的影響

MWM結(jié)果顯示,定位航行實(shí)驗(yàn)中,與WT組比較,APP/PS1組小鼠的運(yùn)動軌跡相對雜亂,潛伏期明顯延長(P＜0.05);與APP/PS1組比較,Yogurt組及Lac.組小鼠的運(yùn)動軌跡相對平緩,潛伏期相對縮短(P＜0.001,P＜0.05)。空間探索實(shí)驗(yàn)中,與WT組比較,APP/PS1組小鼠穿越平臺象限的次數(shù)明顯減少(P＜0.001);與APP/PS1組小鼠比較,Yogurt組及Lac.組小鼠穿越平臺象限的次數(shù)相對增加(P＜0.05);與WT組比較,APP/PS1組小鼠在平臺象限停留時(shí)間明顯縮短(P＜0.05);與APP/PS1組比較,Yogurt組及Lac.組小鼠在平臺象限停留時(shí)間延長(P＜0.05)。各組游泳速度無明顯差異(P＞0.05)。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1。

2.3 藏區(qū)發(fā)酵乳對AD模型小鼠海馬Aβ1-42的影響

免疫組化結(jié)果顯示,Aβ1-42蛋白陽性產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)。與WT組比較,APP/PS1組小鼠海馬Aβ蛋白陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,染色加重,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與APP/PS1組比較,Yogurt組、Lac.組小鼠海馬Aβ蛋白陽性細(xì)胞數(shù)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),詳細(xì)情形及數(shù)據(jù)分別見圖1、表2。ELISA法檢測小鼠血清Aβ1-42含量結(jié)果顯示,與APP/PS1組小鼠相比,Yogurt組小鼠血清Aβ1-42表達(dá)減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),詳細(xì)數(shù)據(jù)見表3。免疫組化結(jié)果和ELISA結(jié)果一致,提示藏區(qū)發(fā)酵乳可降低AD小鼠腦內(nèi)Aβ水平。

表1 各組小鼠MWM結(jié)果的比較Table 1 Comparison of MWM.Results in each group of m ice

圖1 各組小鼠海馬Aβ免疫組化圖Figure 1 Immunohistochem ical.Results of Aβin hippocam pus ofm ice in each group

表2 各組小鼠海馬Aβ免疫組化統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Immunohistochem ical statistics of Aβin hippocampus ofm ice in each group

表3 APP/PS1、Yogurt組小鼠血清Aβ變化情況Table 3 Changes of serum Aβin APP/PS1 and Yogurt group in m ice

2.4 藏區(qū)發(fā)酵乳對AD模型小鼠腦內(nèi)Aβ、TLR4、Myd88、NF-κBp65 蛋白含量的影響

Western

Blot結(jié)果顯示,與WT組比較,APP/PS1

組小鼠腦內(nèi) Aβ、TLR4、MyD88、NF-κBp65 等蛋白的表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與APP/PS1組比較,Yogurt組、Lac.組小鼠腦內(nèi) Aβ、TLR4、MyD88、NF-κBp65等蛋白的表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),詳細(xì)情形及數(shù)據(jù)分別見圖2、表4。

圖 2 各組小鼠海馬內(nèi) Aβ、M yD88、TLR4、NF-κBp65 蛋白表達(dá)圖Figure 2 Protein expression of Aβ,M yD88,TLR4,NF-κBp65 in murine hippocampus

表4 各組小鼠海馬內(nèi)Aβ、M yD88、TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)值Table 4 Protein expression of Aβ,M yD88,TLR4,NF-κBp65 in murine hippocampus

3 討論

AD的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)緩慢、復(fù)雜的病理過程,由于病因不明,因此目前沒有有效治療藥物及措施。研究顯示,牛奶和奶制品攝入量的增加可降低AD的患病風(fēng)險(xiǎn)[13];高奶制品的攝入量與提高認(rèn)知功能有關(guān)[14];食用發(fā)酵乳制品,可能有助于預(yù)防AD[5]。近年來,益生菌作為營養(yǎng)補(bǔ)充品在加工食品中的應(yīng)用越來越廣泛[15],發(fā)酵乳是最受歡迎的益生菌產(chǎn)品之一[16]。根據(jù)國際發(fā)酵乳法典(2008年修訂)標(biāo)準(zhǔn)[17]的定義,發(fā)酵乳是指以鮮牛奶為原料,經(jīng)巴氏殺菌后接種乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)發(fā)酵制成的乳制品。發(fā)酵乳是一種很好的蛋白質(zhì)來源,具有獨(dú)特的特性,可以維持腸道微生物生態(tài)平衡,提高機(jī)體的抵抗力、抑制有害菌對腸道的侵襲[18,19]。益生菌發(fā)酵乳對人體健康的益處包括調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)腸道菌群、降低血清膽固醇和降低腫瘤風(fēng)險(xiǎn)等[20]。

AD的主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙。為了研究藏區(qū)發(fā)酵乳長期干預(yù)對APP/PS1小鼠的保護(hù)作用,我們選擇兩月齡小鼠進(jìn)行為期20 w的灌胃干預(yù)。我們的研究結(jié)果顯示,藏區(qū)發(fā)酵乳組可以減輕APP/PS1小鼠的認(rèn)知障礙,表現(xiàn)在水迷宮實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限停留的時(shí)間延長。這與之前報(bào)道的研究結(jié)果一致[21,22]。本結(jié)果顯示藏區(qū)發(fā)酵乳可減輕APP/PS1模型小鼠Aβ沉積并且改善認(rèn)知功能障礙。免疫組化結(jié)果和ELISA結(jié)果顯示,7月齡AD小鼠腦內(nèi)Aβ表達(dá)增加,藏區(qū)發(fā)酵乳干預(yù)后可降低腦內(nèi)Aβ水平。目前雖然對AD發(fā)病機(jī)制的理解仍無完整明確的闡述,但Aβ含量增加和神經(jīng)炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是影響AD發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素[23]。研究表明,TLR4與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[24],TLR4通過 Myd88激活NF-κB,形成 TLR4/Myd88/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,釋放炎性細(xì)胞因子[25],導(dǎo)致神經(jīng)元炎癥損傷引起Aβ異常聚集;Aβ含量增加,進(jìn)一步引起神經(jīng)炎性反應(yīng),形成惡性循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn),APP/PS1組小鼠腦內(nèi)TLR4、NF-κBp65的表達(dá)水平明顯升高,其下游的MyD88的表達(dá)水平也明顯高于WT組;Yogurt組的NF-κBp65及MyD88水平均降低,說明乳酸菌干預(yù)可以抑制NF-κB活性,抑制炎癥反應(yīng),改善AD病程。

目前有研究發(fā)現(xiàn),腸道微生物群的變化和AD的發(fā)生有關(guān)[26,27],腦-腸軸的紊亂可能在AD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[28],腸道微生物群通過代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能發(fā)揮中起作用[29]。因此,腦-腸軸在維持大腦健康方面起著至關(guān)重要的作用,而腸道菌群是這一軸的主要調(diào)節(jié)器。益生菌利用腦-腸軸來增加神經(jīng)單胺類物質(zhì)〔如多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BNDF)〕的水平,這些物質(zhì)對神經(jīng)元的可塑性和存活至關(guān)重要[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,藏區(qū)發(fā)酵乳能提高AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力,推測它可能通過調(diào)控腦-腸軸,及降低以NF-κBp65為核心的神經(jīng)細(xì)胞炎癥損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述,我們的數(shù)據(jù)顯示,長期攝入藏區(qū)發(fā)酵乳制品可有效改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,這可能與影響Aβ沉積,改善Aβ聚集引起的神經(jīng)炎癥有關(guān)。