肖維，李泉，張洪昌，韋楊年

0 引言

原發(fā)性肝癌具有侵襲性強(qiáng)、致死率高及預(yù)后差等特點(diǎn)，而肝細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌的主要病理分型，約占原發(fā)性肝癌的90%[1]。目前臨床治療肝癌的方式有根治術(shù)、化療及放療等，這些治療方式可在一定程度上遏止癌細(xì)胞擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移，但復(fù)發(fā)率較高、生存率較低[2]。研究表明[3-4]，miRNAs是一種微小的非編碼單鏈RNA分子，其可參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖及凋亡等過(guò)程，且部分miRNAs的表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖、分化有緊密聯(lián)系。miR-96和miR-103在腫瘤組織中呈異常表達(dá)，與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系[5-6]，為了研究原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制，改善患者預(yù)后、延長(zhǎng)患者生存期，本研究探討miR-96與miR-103在肝癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年3月—2014年5月期間我院收治肝細(xì)胞癌患者122例，其中男67例，女55例；年齡40～70歲，平均年齡55.8±5.2歲；肝癌直徑2.0～10.0 cm，平均直徑4.59±0.68 cm；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期82例，Ⅲ～Ⅳ期40例；腫瘤分化程度：低分化51例，中高分化71例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者41例，未轉(zhuǎn)移者81例。本研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核與批準(zhǔn)（倫理學(xué)批準(zhǔn)文號(hào)：ky201302）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者均經(jīng)影像學(xué)和病理組織活檢等確診為肝細(xì)胞癌，且首次診斷為肝癌；（2）年齡18～75歲；（3）患者臨床病例資料齊全；（4）能耐受根治術(shù)、化療或放療等治療手段，且入院前未行相關(guān)治療；（5）患者及其家屬知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并自身免疫系統(tǒng)疾病者；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）心臟、肝及腎等器官有損傷者；（4）合并肝癌轉(zhuǎn)移癌患者；（5）隨訪丟失或不配合者。

1.2 qPCR法檢測(cè)肝癌組織中miR-96和miR-103表達(dá)

選取新鮮的肝癌和癌旁組織各約50 mg，分別用研棒碾碎后應(yīng)用美國(guó)Invitrogen的TRIzol試劑提取肝臟組織總RNA，同時(shí)使用Thermo NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度，260 nm和280 nm吸光度比值范圍為1.8～2.0。將RNA反轉(zhuǎn)錄后行PCR定量檢測(cè)法測(cè)量miR-96和miR-103的相對(duì)表達(dá)量。引物選擇和設(shè)計(jì)：miR-96上游引物：5’-TCTGGGTACCGCACTGGTAGAATTC ACTG-3’，下游引物：5’-CCTTTCTAGACCAC GGCACCATTCAGGA-3’；miR-103上游引物：5’-AGAGCCTGTGGTGTCCG-3’，下游引物：5’-CATCTTCAAAGCACTTCCCT-3’，采用Veriti7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀行PCR反應(yīng)，每組數(shù)據(jù)各測(cè)3次，取平均值。miR-96和miR-103表達(dá)均以U6為參數(shù)值，得到ΔCt值，ΔCt=CtmiR-96/CtmiR-103-CtU6，而2-ΔΔCt即為miR-96和miR-103的相對(duì)值。RQ<2為低表達(dá)，而RQ≥2為高表達(dá)。

1.3 隨訪

對(duì)所有入組患者行治療后隨訪，為期5年，隨訪時(shí)間從患者行手術(shù)、化療等治療措施的第2天開(kāi)始，至患者復(fù)發(fā)、死亡或隨訪時(shí)間到達(dá)為止，隨訪截至2019年5月31日，記錄研究患者半數(shù)生存期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s表示，行配對(duì)t檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)間的比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，近似χ2分布；生存分析單因素行Log rank檢驗(yàn)，多因素分析行Cox回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中miR-96和miR-103的表達(dá)

肝癌組織中miR-96和miR-103相對(duì)表達(dá)水平均顯著高于癌旁正常組織（均P<0.05），見(jiàn)表1、圖1。

表1 旁癌和肝癌組織中miR-96和miR-103的相對(duì)表達(dá)量 (±s)Table 1 Relative expression of miR-96 and miR-103 in hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues (±s)

表1 旁癌和肝癌組織中miR-96和miR-103的相對(duì)表達(dá)量 (±s)Table 1 Relative expression of miR-96 and miR-103 in hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues (±s)

圖1 qPCR法檢測(cè)肝癌組織中miR-96和miR-103的相對(duì)表達(dá)量Figure 1 Relative expression of miR-96 and miR-103 in hepatocellular carcinoma tissues detected by qPCR

2.2 肝癌組織中miR-96和miR-103的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

肝癌組織中miR-96和miR-103表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及分化程度均有關(guān)（均P<0.05），而與性別、年齡及合并肝硬化等無(wú)關(guān)（均P>0.05），見(jiàn)表2。

2.3 肝癌患者預(yù)后影響因素

單因素分析結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌患者中位生存時(shí)間與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分化程度、miR-96和miR-103表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。多因素分析顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ（OR=1.335,95%CI:1.029～1.733）、分化程度為低分化（OR=2.018,95%CI:1.026～3.968）、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移（OR=1.505,95%CI:1.146～1.977）、miR-96高表達(dá)（OR=2.319,95%CI:1.902～2.826）和miR-103高表達(dá)（OR=2.006,95%CI:1.449～2.777）是肝癌患者中位生存時(shí)間獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3～4、圖2。

表2 肝癌組織miR-96和miR-103高表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Correlation of high miR-96 and miR-103 expression with clinicopathological features of hepatocellular carcinoma patients

3 討論

肝細(xì)胞癌是國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率僅次于肺癌，而肝癌隱匿性較強(qiáng)，患者有明顯臨床癥狀時(shí)多為中晚期，且肝癌易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者生命安全[7]。有研究[8]顯示，病毒性肝炎、肝硬化、黃曲霉素、環(huán)境污染及遺傳等因素是肝細(xì)胞癌的主要獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前肝癌根治術(shù)是治療肝癌最經(jīng)濟(jì)、現(xiàn)實(shí)和可靠的首選方法，但肝癌患者確診時(shí)多為中晚期，預(yù)后較差[9]?，F(xiàn)階段肝癌預(yù)后評(píng)估尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，年齡、肝功能狀態(tài)、腫瘤分型和大小、肝癌擴(kuò)散程度及手術(shù)治療均可影響患者預(yù)后[10]，但無(wú)法通過(guò)上述諸因素準(zhǔn)確評(píng)估，因而找尋有效的高敏感度和高特異性的診斷和預(yù)后判斷因子，對(duì)準(zhǔn)確評(píng)估患者預(yù)后、延長(zhǎng)患者生存期有重要的價(jià)值。miRNAs可參與蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程調(diào)節(jié)目標(biāo)基因，在多種生物學(xué)信號(hào)通路中發(fā)揮作用[11]?，F(xiàn)階段有研究表明[12]，有部分miRNA與肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖及凋亡等過(guò)程密切相關(guān)。miR-103在肝癌患者體內(nèi)呈異常表達(dá)，且可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲過(guò)程，與肝癌臨床分期相關(guān)[13]。而張國(guó)強(qiáng)等[14]證實(shí)miR-96可通過(guò)調(diào)節(jié)新型轉(zhuǎn)錄抑制因子鋅指和同源框2（zinc-fingers and homeoboxes 2,ZHX2）誘導(dǎo)正常機(jī)體肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程，參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移惡化等過(guò)程。

表3 原發(fā)性肝癌患者中位生存時(shí)間與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 3 Relation between median survival time and clinicopathologic parameters of patients with primary hepatocellular carcinoma

表4 肝癌患者中位生存時(shí)間影響因素Cox回歸分析Table 4 Cox regression analysis of influencing factors for median survival time of hepatocellular carcinoma patients

圖2 miR-96(A)和miR-103(B)不同表達(dá)肝癌患者的生存曲線Figure 2 Survival curves of hepatocellular carcinoma patients with different expression of miR-96(A) and miR-103(B)

本研究結(jié)果顯示，肝癌組織miR-96和miR-103表達(dá)水平均顯著高于癌旁正常組織，說(shuō)明miR-96和miR-103高表達(dá)可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步分析其表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，肝癌組織miR-96和miR-103表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及分化程度均有關(guān)（均P<0.05），而與性別、年齡及合并肝硬化等無(wú)關(guān)（均P>0.05）。說(shuō)明腫瘤直徑越大、TNM分期越晚、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移及分化程度越低，miR-96和miR-103表達(dá)率越高。單因素分析結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌患者中位生存時(shí)間與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分化程度、miR-96和miR-103表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將上述單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素行Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-96和miR-103高表達(dá)是肝癌患者中位生存時(shí)間獨(dú)立危險(xiǎn)因素。分析認(rèn)為，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的常見(jiàn)方式，浸潤(rùn)的腫瘤細(xì)胞穿透淋巴管壁，脫落后以淋巴結(jié)為中心繼續(xù)生長(zhǎng)分化相同的癌細(xì)胞，加重患者病情[15]。中高分化型腫瘤細(xì)胞多表現(xiàn)為成熟形態(tài)，生長(zhǎng)緩慢，惡性程度較低，轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)間較晚[16]；TNM分期的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)是原發(fā)腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況，病理分化程度越差，癌細(xì)胞惡性程度越高，預(yù)后越差[17]。

研究表明[12]，miRNA與癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等有一定的相關(guān)性，miR-96可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞骨橋細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞惡性增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲的能力，介導(dǎo)肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，進(jìn)而影響預(yù)后[18]。趙新陽(yáng)等[19]研究表明，蛋白酪氨酸磷酸酶的高表達(dá)可通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑發(fā)揮抑癌作用，而miR-96則通過(guò)下調(diào)其表達(dá)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。miR-103高表達(dá)可有機(jī)結(jié)合其潛在靶向基因LATS2，進(jìn)而拮抗其作用，以發(fā)揮誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移及侵襲等功效，患者病情惡化，生存時(shí)間縮短[20]。本研究對(duì)象僅限于指定時(shí)間內(nèi)來(lái)我院救治的122例肝癌患者，在人文環(huán)境、家庭教育、醫(yī)院環(huán)境及治療手段等方面存在的差異可能會(huì)使分析結(jié)果造成誤差，仍需擴(kuò)充研究對(duì)象樣本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但除去以上因素，本研究選用經(jīng)驗(yàn)豐富的主治醫(yī)生和高年資護(hù)理人員，盡量避免人為誤差對(duì)結(jié)果的影響。

綜上所述，肝癌組織中miR-96和miR-103高表達(dá)是肝癌患者預(yù)后差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)術(shù)后評(píng)估患者預(yù)后和生存時(shí)間有一定臨床意義和價(jià)值。