葉冬雪，劉芬，楊茜，付海洋，周璇，項(xiàng)鋒鋼

0 引言

肝細(xì)胞肝癌（HCC）是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率及死亡率，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1]。近年來，盡管在肝細(xì)胞肝癌早診、早治方面已取得巨大進(jìn)步，但患者總體預(yù)后仍較差[2-3]。因此，尋找影響肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展的有效標(biāo)志物，對(duì)研究肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病機(jī)制及靶向治療具有重要的臨床意義。

色素框同源蛋白8（chromobox protein homolog 8,CBX8）是CBX蛋白家族的重要成員之一，通過參與組蛋白甲基化、染色體重構(gòu)等過程，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[4]。研究表明，CBX8在食管癌、膀胱癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中異常表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-8]。Mina53是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的新基因，位于染色體3q12.1上，是原癌基因C-myc誘導(dǎo)的下游靶基因之一，主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，影響組蛋白的甲基化狀態(tài)，或參與染色體重構(gòu)[9-10]。已有研究表明，Mina53蛋白在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其高表達(dá)促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，并提示患者預(yù)后不良[11-15]。本研究聯(lián)合檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌及相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織中Mina53和CBX8的表達(dá)，旨在探討兩者的表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為肝細(xì)胞肝癌的診斷和治療提供新的思路和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2014年2月—2015年1月肝細(xì)胞肝癌手術(shù)切除標(biāo)本121例，包括肝細(xì)胞肝癌與相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織（距腫瘤邊緣>5 cm）。其中男109例，女12例，年齡32～83歲，平均年齡57.07±9.07歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟及美國腫瘤聯(lián)合會(huì)制定的第七版TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行臨床病理分期。依據(jù)免疫組織化學(xué)方法判斷肝癌標(biāo)本是否血管受侵，CD31標(biāo)記顯示血管，若在血管內(nèi)發(fā)現(xiàn)癌栓，則認(rèn)為有血管受侵。所有患者臨床病理資料完整，術(shù)前均未行放、化療，且定期電話隨訪，其中85例術(shù)后隨訪已滿五年且有完整的隨訪資料。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

Mina53鼠抗人單克隆抗體（M532）購于美國Thermo Fisher Scientific公司，工作濃度1:50，CBX8兔抗人多克隆抗體（HPA031462）購于美國Sigma公司，工作濃度1:25；羊抗兔抗體（ab6721）購于英國Abcam公司；羊抗鼠抗體（LK2003）購于天津三箭生物技術(shù)有限公司；PV-6000購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 構(gòu)建組織芯片 石蠟包埋的組織切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后，由兩位病理醫(yī)師閱片，鏡下選取典型區(qū)域，用孔徑為1.5 mm的細(xì)針對(duì)蠟塊打孔，采集組織芯矩形排列于受體蠟塊中，53℃融合，4 μm連續(xù)切片。組織芯片經(jīng)HE染色后，由病理醫(yī)師復(fù)檢選取的組織芯片是否符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 采用PV6000法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，石蠟包埋組織經(jīng)脫蠟、水化后，微波加熱修復(fù)抗原，液體沸騰后5 min停止（1 mmol/L EDTA,pH8.0），自然冷卻，滴加3%H2O2室溫處理10 min，PBS沖洗3次，每次3 min，孵育一抗4℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min，37℃孵育二抗30 min，PBS沖洗3次，每次3 min，DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色，中性樹膠封片。用已知陽性表達(dá)Mina53的結(jié)腸癌組織、非腫瘤區(qū)的腎小管上皮組織和已知陽性表達(dá)CBX8的肺癌組織作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 判讀標(biāo)準(zhǔn)

HE染色后，組織芯片中細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色記為Mina53陽性表達(dá)，胞核及胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色記為CBX8陽性表達(dá)。判讀標(biāo)準(zhǔn)按染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分[16]，染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無著色：0分（-），黃色：1分（+），棕黃色：2分（++），棕褐色：3分（+++）；陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分（＜5%），1分（5%～25%），2分（>25%～50%），3分（>50%～75%），4分（>75%）。免疫組織化學(xué)染色總分=染色強(qiáng)度得分+陽性細(xì)胞百分比得分，<4分為低表達(dá)，≥4分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman法；Kaplan-Meier法、Log rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析；采用Cox回歸模型進(jìn)行單因素、多因素生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞肝癌及相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織中Mina53和CBX8的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Mina53主要在細(xì)胞核中表達(dá)，121例肝細(xì)胞肝癌組織中，53例高表達(dá)，68例低表達(dá)；而癌旁相對(duì)正常組織中均為低表達(dá)；CBX8在細(xì)胞核及胞質(zhì)中均有表達(dá)，以細(xì)胞核為主，121例肝細(xì)胞肝癌組織中，63例高表達(dá)，58例低表達(dá)；而癌旁相對(duì)正常組織中均為低表達(dá)，見圖1。Mina53和CBX8在肝細(xì)胞肝癌中的平均表達(dá)量明顯高于其相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001），見表1。

表1 Mina53、CBX8在肝細(xì)胞肝癌和相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織中表達(dá)的比較Table 1 Comparison of Mina53 and CBX8 expressions in HCC and adjacent non-tumor tissues

2.2 Mina53、CBX8在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

Mina53表達(dá)水平與腫瘤大小、被膜侵犯、脈管侵犯、病理分級(jí)、TNM分期相關(guān)（均P<0.05），而與年齡、性別、血清AFP水平、乙肝表面抗原（HBsAg）、合并肝硬化、腫瘤多發(fā)性無關(guān)（均P>0.05）；CBX8表達(dá)水平與乙肝表面抗原（HBsAg）、腫瘤大小、被膜侵犯、TNM分期相關(guān)（均P<0.05），而與年齡、性別、血清AFP水平、合并肝硬化、脈管侵犯、腫瘤多發(fā)性、病理分級(jí)無關(guān)（均P>0.05），見表2。

2.3 肝細(xì)胞肝癌中Mina53與CBX8表達(dá)的相關(guān)性

121例肝細(xì)胞肝癌中，42例Mina53與CBX8均高表達(dá)，47例兩者均低表達(dá)。在不同Mina53表達(dá)狀態(tài)下，對(duì)CBX8的表達(dá)情況進(jìn)一步分析顯示：Mina53高表達(dá)患者中，CBX8高表達(dá)率為79.25%（42/53）明顯高于Mina53低表達(dá)患者中的CBX8高表達(dá)率30.88%（21/68）。肝細(xì)胞肝癌組織中Mina53與CBX8的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（P<0.01），見表3。

2.4 Mina53、CBX8與肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)后生存的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示：Mina53與CBX8均低表達(dá)者的總生存時(shí)間（OS）為59.00±0.57月，Mina53或CBX8高表達(dá)者的OS為52.04±2.77月，兩者均高表達(dá)者的OS為40.71±3.30月，見圖2A；Mina53與CBX8均低表達(dá)者的無疾病生存時(shí)間（DFS）為56.39±1.24月，Mina53或CBX8高表達(dá)者的DFS為44.20±3.51月，兩者均高表達(dá)者的DFS為31.31±3.61月，見圖2B。Mina53與CBX8均高表達(dá)患者的OS和DFS較Mina53或CBX8高表達(dá)者及兩者均低表達(dá)者更短，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001）。

2.5 Cox模型分析影響肝細(xì)胞肝癌的獨(dú)立預(yù)后因素

Cox單因素回歸模型分析顯示：病理分級(jí)、腫瘤大小、脈管侵犯、腫瘤多發(fā)性、TNM分期、Mina53、CBX8表達(dá)水平均為影響肝細(xì)胞肝癌患者OS的危險(xiǎn)因素（均P<0.05）；病理分級(jí)、腫瘤大小、脈管侵犯、腫瘤多發(fā)性、Mina53表達(dá)水平、CBX8表達(dá)水平均為影響肝細(xì)胞肝癌患者DFS的危險(xiǎn)因素（均P<0.05）。進(jìn)一步多因素分析顯示：Mina53、CBX8表達(dá)水平及腫瘤大小是影響肝細(xì)胞癌患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素（均P<0.05），Mina53及CBX8表達(dá)水平、腫瘤大小及脈管侵犯是影響肝細(xì)胞肝癌患者DFS的獨(dú)立預(yù)后因素（均P<0.05），見表4～5。

圖1 Mina53、CBX8在肝細(xì)胞肝癌及相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織中的表達(dá) (×200)Figure 1 Expressions of Mina53 and CBX8 in HCC and adjacent non-tumor tissues (×200)

表2 Mina53、CBX8的表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Correlation of Mina53 and CBX8 expressions with clinicopathological features of HCC patients

表3 肝細(xì)胞肝癌組織中Mina53與CBX8表達(dá)的相關(guān)性Table 3 Correlation between expressions of Mina53 and CBX8 in HCC tissues

圖2 Mina53、CBX8表達(dá)水平與肝細(xì)胞肝癌患者總體生存時(shí)間(A)和無疾病生存時(shí)間(B)的關(guān)系Figure 2 Correlation of Mina53 and CBX8 expressions with overall survival(A) and disease-free survival(B) of HCC patients

3 討論

肝細(xì)胞肝癌惡性程度高、起病隱匿、進(jìn)展快，多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期，易失去手術(shù)機(jī)會(huì)，且肝細(xì)胞肝癌術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致五年生存率較低，肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段漸進(jìn)演化的病理過程，涉及多種基因的異常表達(dá)和表觀遺傳學(xué)的改變，但其發(fā)病的確切分子機(jī)制尚不清楚。

Mina53是近幾年發(fā)現(xiàn)的新基因，其編碼蛋白的分子量為53 kDa，包含一個(gè)高度保守的JmjC結(jié)構(gòu)域，呈β折疊結(jié)構(gòu)，可能參與染色體重構(gòu)的調(diào)節(jié)及組蛋白表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)過程[17-18]。近年來已有研究證實(shí)，Mina53可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及分化過程，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。Di Croce等在果蠅中發(fā)現(xiàn)PcG基因家族，CBX8作為PcG蛋白家族中的重要成員，具有高度保守性，可與RING1a/b、BMI1等蛋白分子組成多梳蛋白抑制復(fù)合體1（polycomb repressive complex1,PRC1），參與組蛋白甲基化、染色體重構(gòu)等過程[4]。研究顯示，CBX8蛋白在腫瘤組織中的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切。

有研究發(fā)現(xiàn)Mina53在腎細(xì)胞癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)升高，且其高表達(dá)與腫瘤分化、TNM分期和浸潤深度有關(guān)[12-13]。Ogasawara等通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Mina53在肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)升高，且與腫瘤大小、病理分級(jí)相關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，Mina53在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于其相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織。異常表達(dá)的Mina53蛋白主要分布在細(xì)胞核中，在腫瘤增殖能力強(qiáng)、分化程度差、有被膜侵犯和脈管侵犯且TNM分期晚的患者中Mina53的表達(dá)水平增高；有研究表明CBX8在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)量明顯升高且與腫瘤的大小、分化、分期及轉(zhuǎn)移有關(guān)[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)CBX8主要表達(dá)于細(xì)胞核與胞質(zhì)中，其在腫瘤組織中高表達(dá)與患者是否攜帶HBsAg、腫瘤大小、被膜侵犯、TNM分期相關(guān)。以上結(jié)果表明，Mina53和CBX8高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及其對(duì)鄰近正常組織的浸潤侵襲，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。

表4 單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肝細(xì)胞肝癌患者總體生存時(shí)間的因素Table 4 Univariate and multivariate Cox regression analyses of influence factors for overall survival of HCC patients

Wang等通過免疫共沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞中Mina53蛋白和PRC1復(fù)合物的亞基CBX8蛋白存在相互作用，Mina53可能通過CBX8蛋白的調(diào)控發(fā)揮其功能[22]。我們通過Spearman相關(guān)分析也證實(shí)肝細(xì)胞肝癌中Mina53和CBX8的表達(dá)呈正相關(guān)，且Mina53高表達(dá)的肝細(xì)胞肝癌患者中CBX8高表達(dá)者的比例更高，提示Mina53與CBX8在肝細(xì)胞肝癌進(jìn)展過程中具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)肝腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。

表5 單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肝細(xì)胞肝癌患者無疾病生存時(shí)間的因素Table 5 Univariate and multivariate Cox regression analyses of influence factors for disease-free survival of HCC patients

有研究表明，CBX8的表達(dá)水平與腫瘤患者的術(shù)后生存有關(guān)，且CBX8高表達(dá)往往提示患者預(yù)后不良，但結(jié)直腸癌中CBX8的高表達(dá)與患者預(yù)后良好有關(guān)[8,21,23]。在結(jié)腸癌、胰腺癌等多種腫瘤中Mina53高表達(dá)患者的術(shù)后生存期比低表達(dá)者更短[11,13]，而乳腺癌中Mina53高表達(dá)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者預(yù)后良好[14]。由此可見，Mina53與CBX8對(duì)不同腫瘤患者預(yù)后的影響有所差異。本研究發(fā)現(xiàn)，Mina53與CBX8均高表達(dá)患者的OS和DFS較Mina53或CBX8高表達(dá)者及兩者均低表達(dá)者更短，提示Mina53與CBX8是影響肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后的重要因素。此外，Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，Mina53、CBX8表達(dá)水平、腫瘤大小是影響患者OS和DFS的獨(dú)立預(yù)后因素。以上結(jié)果表明，Mina53和CBX8的表達(dá)水平與肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后密切相關(guān)，兩者協(xié)同高表達(dá)提示患者預(yù)后不良；Mina53和CBX8的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)評(píng)估患者預(yù)后有重要意義，可作為預(yù)測(cè)肝細(xì)胞肝癌預(yù)后有效的生物標(biāo)志物。

綜上所述，Mina53和CBX8在肝細(xì)胞肝癌組織中高表達(dá)，兩者在肝細(xì)胞肝癌中具有協(xié)同作用，可能促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移。聯(lián)合檢測(cè)Mina53和CBX8有助于肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后判斷，有望成為新的肝細(xì)胞肝癌分子治療靶點(diǎn)。