溫室大棚土壤生物修復(fù)劑的菌種選育及應(yīng)用效果

摘要：采用紫外線誘導(dǎo)和化學(xué)誘變相結(jié)合的方法，對生防木霉T11菌株進(jìn)行選育得到T11-5-2變異菌株。該菌株在多菌靈濃度為100 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于25 ℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，用HPLC-MS檢測顯示，處理 2 d 的培養(yǎng)液中檢測出多菌靈和3種代謝產(chǎn)物;處理5 d的培養(yǎng)液經(jīng)檢測未發(fā)現(xiàn)多菌靈和代謝產(chǎn)物;以玉米秸稈為原料，在溫度為 25 ℃ 條件下固體發(fā)酵6 d，制成生物修復(fù)劑。該修復(fù)劑可有效降解5種常用農(nóng)藥，并對黃瓜灰霉病的活體防治效果達(dá)到79.5%，優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥多菌靈。

關(guān)鍵詞：溫室大棚;木霉;生物修復(fù);代謝物;多菌靈

由于溫室大棚的不易遷移和常年重茬種植同一種作物，土壤中大量土傳病原菌滋生繁殖，易引發(fā)植物病害。而病害的頻繁發(fā)生，又促使農(nóng)民用藥次數(shù)增加，致使土壤中農(nóng)藥殘留升高，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致棚內(nèi)土壤生態(tài)平衡受到嚴(yán)重破壞。筆者對蔬菜大棚內(nèi)土壤采用多點(diǎn)采樣進(jìn)行檢測分析，然后與同一地未建大棚的耕地土壤檢測數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)棚內(nèi)土壤中的農(nóng)藥殘留量是非大棚耕地的3.6倍，而細(xì)菌、放線菌、霉菌等微生物種群卻減少4～6倍?？梢?，化學(xué)農(nóng)藥的大量、重復(fù)使用，使土壤中的農(nóng)藥殘留量大幅增加，不僅使生產(chǎn)的農(nóng)產(chǎn)品殘留超標(biāo)，而且還破壞了土壤的微生態(tài)平衡，導(dǎo)致微生物數(shù)量大幅減少。隨著人們生活水平的提高，對食品安全和環(huán)境安全也提出了更高要求。無藥物殘留、無副作用的綠色農(nóng)副產(chǎn)品越發(fā)受到人們青睞。因此，對溫室大棚內(nèi)的土壤進(jìn)行生物修復(fù)意義重大。目前，國內(nèi)外對多菌靈降解菌的研究多集中于細(xì)菌，且均為液體降解研究[1-9]。

木霉（Trichoderma sp.）T11菌株，是筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離出的高效生防真菌菌株，對灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、鐮刀菌（Fasarium spp.）等多種土傳病原菌具有良好的抑制作用;通過藥物馴化、紫外線誘導(dǎo)和化學(xué)誘導(dǎo)相結(jié)合的方法，對篩選出的生防木霉T11菌株進(jìn)行改良，得到T11-5-2木霉變異菌株。使其在保持對多種病原菌有良好拮抗性的同時(shí)，對速克靈、多菌靈等化學(xué)農(nóng)藥殘留有顯著的降解效果，可使生產(chǎn)的蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品有害殘留量大幅降低，達(dá)到綠色食品標(biāo)準(zhǔn)。農(nóng)藥殘留被降解為二氧化碳和水，對環(huán)境不會(huì)造成二次污染，同時(shí)，還可以防治農(nóng)作物灰霉病、枯萎病、霜霉病等常見和多發(fā)病害，使土壤修復(fù)、農(nóng)藥殘留降解和土傳病害的防治有機(jī)結(jié)合，從而大幅提高勞動(dòng)生產(chǎn)效率、降低成本，有效提高大棚蔬菜的經(jīng)濟(jì)效益，有較高的應(yīng)用前景和推廣價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料主要有木霉（Trichoderma sp.）T11降解菌株，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室在農(nóng)藥廠土壤中分離、選育得到;50%多菌靈可濕性粉劑，由江蘇靖江農(nóng)藥廠提供;馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15 g瓊脂，1 000 mL水，pH值自然;PDA藥物培養(yǎng)基：把PDA培養(yǎng)基熔化后，加入一定量多菌靈粉劑混合均勻后倒入平板制得;無機(jī)鹽培養(yǎng)基：5.710 g K2HPO4，1.700 g KH2PO4，2.630 g（NH4）2SO4，0.095 g MgSO4·7H2O，0.050 g MnSO4，0.05 g FeSO4，0.003 g CaCl2，1 000 mL 水，pH值為7.0;甲基磺酸乙酯（ethylmethylsulfone，簡稱EMS），由上海艾研生物科技有限公司提供。

1.2 紫外線多重誘導(dǎo)及藥物馴化處理

在接種木霉菌株T11于25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d的PDA培養(yǎng)基平板上，加入50 mL無菌水，輕輕洗刷綠色分生孢子，制成107個(gè)/mL孢子懸浮液。在含多菌靈 10 mg/L 的PDA藥物培養(yǎng)基上涂抹0.1 mL上述孢子懸浮液。去蓋在20 W、波長為253.7 nm的紫外燈管下30 cm處，避光照射后立即用黑紙包好，放入25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每次照射時(shí)間為 60 min。每個(gè)處理重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)平板上菌落數(shù)并將其轉(zhuǎn)接到含10 mg/L多菌靈的PDA藥物培養(yǎng)基上。選取生長迅速的變異木霉菌株，待產(chǎn)生大量綠色分生孢子后，再按上述方法配制孢子懸浮液，涂抹在含 20 mg/L 多菌靈PDA藥物培養(yǎng)基上，進(jìn)行第2次紫外線重復(fù)誘導(dǎo)和馴化處理。依此類推，逐步提高多菌靈濃度達(dá)到1 500 mg/L，獲降解性變異菌株T11-5。

1.3 化學(xué)誘導(dǎo)處理

在接種木霉菌株T11-5于25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d的PDA培養(yǎng)基平板上，刮取少量綠色分生孢子，用無菌生理鹽水和0.1 mol/L磷酸鉀緩沖溶液（pH值為5.0）各洗滌1～2次后，將洗好的T11-5菌株分生孢子懸浮于含有10 g/L甲基磺酸乙酯的磷酸鉀溶液（pH值=5.0）中，25 ℃振蕩處理1～2 h。取 10 mL 處理后的懸液用0.16 mol/L硫代硫酸鈉溶液稀釋10倍終止反應(yīng)，離心收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌后，加入無菌水，制成107個(gè)/mL孢子懸浮液，取0.1 mL上述孢子懸浮液均勻涂在PDA培養(yǎng)基平板上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，從平板上挑取菌落較大的進(jìn)行純化。最后得到能在多菌靈濃度達(dá)到 2 000 mg/L 的PDA平板上良好生長的變異菌株T11-5-2。

1.4 菌株T11-5-2對多菌靈降解

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入100 mg/L多菌靈，以5%接種量接入木霉T11-5-2種子液，于25 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)。2、5 d后分別取樣1次，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）檢測培養(yǎng)液中多菌靈及代謝產(chǎn)物含量[10]。

1.5 對其他幾種常用農(nóng)藥的降解

在pH值為6.0的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入100 mg/L多菌靈、速克靈、撲海因、甲基托布津、三唑酮，以5%接種量接入種子液，于25 ℃、200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)5 d，取樣分別測定各自農(nóng)藥的殘留量[11]并計(jì)算降解率。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.6 制備種子液

液體培養(yǎng)基：8～10 mL馬鈴薯浸出液，0.2～0.4 g （NH4）2SO4，0.2～0.3 g K2HPO4，1 g CaCO3，補(bǔ)加水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至6.0～6.5。取上述培養(yǎng)液100 mL，高壓滅菌20～30 min。冷卻后接入已活化好的木霉菌T11-5-2菌株，于25～26 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，用分光光度計(jì)測量D600 nm達(dá)到0.30～0.35 停止液體發(fā)酵。發(fā)酵液作為種子液備用。

1.7 固體發(fā)酵

固體培養(yǎng)基：10 g玉米秸稈粉（粉碎至30～40目），3 g麩皮，0.8～0.9 g葡萄糖，0.20～0.40 g（NH4）2SO4，0.10～0.20 g KH2PO4，0.08～0.10 g MgS04·7H2O，1 000 mL水，調(diào)節(jié)pH值至6.0～6.5。高壓滅菌30 min，冷卻后接入上述T11-5-2菌株種子液100～130 mL，攪拌均勻，放在25～26 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，用血球計(jì)數(shù)板測量固體發(fā)酵物的分生孢子量達(dá)到1010 個(gè)/g，即可結(jié)束固體發(fā)酵出料，常溫風(fēng)干或使用真空干燥器控制溫度在45 ℃左右干燥。即可得到復(fù)合生物修復(fù)劑。

1.8 生物防效試驗(yàn)

經(jīng)過固體培養(yǎng)基發(fā)酵獲得木霉T11-5-2菌株分生孢子粉，把孢子粉和多菌靈可濕性粉劑用無菌水稀釋800倍，各取一定量藥液與等量灰霉菌孢子懸浮液（孢子濃度為105個(gè)/mL）混合均勻，然后噴施在盆栽黃瓜苗上。每盆種植8株津青1號(hào)黃瓜，每株留3片復(fù)葉，用藥10 mL/株。并噴施等量無菌水作空白對照。于20 ℃恒溫保濕3 d，調(diào)查葉片發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率和防治效果。每個(gè)處理4盆，重復(fù)3次。

發(fā)病率=感病株數(shù)/總株數(shù)×100%;? 防治效果=（對照發(fā)病率-用藥發(fā)病率）/對照發(fā)病率×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株T11-5-2對多菌靈的降解試驗(yàn)

對處理多菌靈2 d的培養(yǎng)液采用HPLC-MS分析，結(jié)果出現(xiàn)4個(gè)峰（圖1），結(jié)合相應(yīng)的質(zhì)譜分析認(rèn)為，代謝產(chǎn)物A為2-氨基苯腈、B為2-氨基苯并咪唑、C為苯并咪唑、D為未降解的殘留多菌靈，保留時(shí)間分別為1.42、1.81、2.42、3.14 min。而在對T11-5-2菌株處理多菌靈5 d的培養(yǎng)液進(jìn)行HPLC-MS分析時(shí)，卻未再檢測出代謝產(chǎn)物和多菌靈殘留（圖2）。說明T11-5-2菌株5 d已完全降解100 mg/L的多菌靈，且經(jīng)過10次繼代轉(zhuǎn)接后降解效果仍較穩(wěn)定。

對多菌靈經(jīng)過5 d處理，通過HPLC-MS分析，已經(jīng)檢測不到多菌靈及其降解物的存在，已經(jīng)被徹底轉(zhuǎn)化為成二氧化碳和水，對環(huán)境不會(huì)產(chǎn)生二次污染。

2.2 對其他幾種常用農(nóng)藥的降解

由圖3可知，降解菌對速克靈、多菌靈的降解率分別高達(dá)98.1%、90.4%，對撲海因、甲基托布津、三唑酮的降解率分別達(dá)到86.5%、40.1%、55.3%。表明該降解菌株對5種不同類型的化學(xué)農(nóng)藥均具較好的降解作用，表明T11-5-2菌株具有較廣泛的降解能力，這在降解菌的研究中還未見報(bào)道過。

由于農(nóng)作物病害種類繁多，施用1種農(nóng)藥已不能完全達(dá)到防病效果，為保證穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)，往往會(huì)在田間施用多種農(nóng)藥，因此降解菌株能夠?qū)Χ喾N農(nóng)藥具有降解特性是十分必要且應(yīng)用價(jià)值極高的。

2.3 生物防效試驗(yàn)

試驗(yàn)前應(yīng)把盆栽黃瓜用水澆透，然后噴施各處理800倍藥液。于20 ℃恒溫保濕處理3 d，調(diào)查感病葉片數(shù)。

活體拮抗性試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，木霉菌對黃瓜灰霉病的防治效果可達(dá)到79.5%，優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥多菌靈的防治效果（71.7%），且差異明顯。這充分表明木霉T11-5-2菌株除具有良好的降解效果外，還具有優(yōu)良的對土傳病害防治效果。

3 結(jié)論

通過藥物馴化、紫外線誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)相結(jié)合的方法，人工選育出木霉變異菌株T11-5-2，在多菌靈濃度為100 mg/L條件下，于25 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，可完全降解多菌靈。以玉米秸稈為主要原料，通過固體發(fā)酵6 d，制備的修復(fù)劑分生孢子數(shù)達(dá)到1.4×1010 CFU/g。木霉菌株T11-5-2對濃度為 100 mg/L 的速克靈、多菌靈、撲海因、三唑酮、甲基托布津在最適條件下處理5 d，降解率分別達(dá)到 98.1%、90.4%、86.5%、55.3%、40.1%。木霉菌對黃瓜灰霉病的防治效果可達(dá)到79.5%，優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥多菌靈的防治效果（71.7%），且差異明顯。

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