崔方強 高彥彬 王悅芬 孟元 蔡朕 劉志強 江心燦 趙文景

隨著糖尿病發(fā)病率的逐年升高,糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)已經(jīng)成為導致終末期腎病的主要原因[1-2]。腎小球細胞外基質(zhì)增生是DN典型的病理改變,能夠引起蛋白尿的產(chǎn)生及疾病的進展[3]。但是DN腎小球細胞外基質(zhì)增生的病理基質(zhì)目前并不清楚,因此缺少相應(yīng)的治療措施。研究證實,足細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化在DN腎小球細胞外基質(zhì)增生過程中起著重要作用[4]。足細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)不僅可以引起蛋白尿,也可以導致腎小球Collagen I及FN蛋白累積,介導腎小球細胞外基質(zhì)增生及腎小球硬化[5]。因此抑制足細胞EMT是DN防治研究的熱點。糖腎寧廣泛應(yīng)用于臨床防治DN,并且臨床試驗已經(jīng)證實其具有確切的臨床療效[6],本實驗旨在探討糖腎寧對于KK-Ay小鼠腎小球細胞外基質(zhì)增生及足細胞EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡雄性KK-Ay小鼠及8周齡雄性C57BL/6J小鼠全部購自全部購自北京華阜康生物科技股份有限公司,實驗動物許可證號：SCXK(京)2014-0004。

1.2 實驗試劑及藥物

Collagen I抗體(ab34710,abcam,英國),FN抗體(ab2413,abcam,英國),P-cadherin抗體(ab6528,abcam,英國),FSP-1抗體(ab27957,abcam,英國),肌酐測定試劑盒(批號：657881,ROCHE,瑞士),尿素氮測定試劑盒(批號：658513,ROCHE,瑞士),糖腎寧浸膏粉(配比：黃芪4份、葛根2份、川芎2份、大黃1份、金櫻子2份、倒扣草3份,由首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院制劑室制備),纈沙坦膠囊(北京諾華制藥有限公司,批號：X1440)。

1.3 實驗儀器

離心機(Sigma,3K18),倒置顯微鏡(德國Leica公司)；凝膠化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(FUSION FX6 XT,Vilber公司)；高電流電泳儀電源(美國伯樂公司)；酶標儀(北京市新風機電技術(shù)公司,ZS-3)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型建立及分組給藥 KK-Ay小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng),C57BL/6J小鼠給予普通飼料喂養(yǎng),喂養(yǎng)期間小鼠自由進食及飲水,4周后檢測血糖及24小時尿蛋白定量。當KK-Ay小鼠隨機血糖≥16.7 mmol/L,并且24小時尿蛋白較 C57BL/6J小鼠明顯升高時,DN小鼠模型造模成功。將造模成功的KK-Ay小鼠隨機分為模型組、糖腎寧組、纈沙坦組,每組10只。另取10只C57BL/6J小鼠作為正常對照組。各組小鼠給予灌胃給藥干預：糖腎寧組小鼠給予糖腎寧灌胃劑,灌胃劑量按生藥劑量計算為20 g/(kg·d)；纈沙坦組小鼠給予纈沙坦灌胃劑,灌胃劑量為10 mg/(kg·d)；正常對照組和模型組予等量蒸餾水灌胃。實驗過程中,KK-Ay小鼠繼予高脂飼料喂養(yǎng),而C57BL/6J小鼠予普通飼料喂養(yǎng)。干預12周后,心尖取血,處死后摘取腎臟。

1.4.2 PAS染色 腎臟組織固定后進行石蠟切片,然后進行程序化脫蠟,用無色鹽基性品紅溶液對石蠟切片染色。流水沖洗后,蘇木精染料染色5～10分鐘。將石蠟切片脫水透明后,中性樹脂封片。

1.4.3 免疫組化 腎臟組織固定后進行石蠟切片,然后程序化脫蠟,組織切片抗原修復后,用山羊血清進行封閉。將配制好的一抗溶液(Collagen I 1∶1000,FN 1∶1000)滴加到玻片上,4℃孵育過夜。沖洗后滴加二抗室溫孵育1小時。蘇木精染色后進行脫水透明,中性樹脂封片。

1.4.4 Western Blot 每組選取4例小鼠進行檢測。腎臟蛋白組織電泳后,將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,滴加配制好的一抗溶液(P-cadherin 1∶500,FSP-1 1∶500),4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗室溫孵育2小時,ECL試劑暗室內(nèi)膠片曝光,掃描膠片,用圖像分析軟件分析目標條帶。

1.4.5 實時熒光定量PRC 每組選取5例小鼠進行檢測。采用Trizol提取小鼠腎臟總RNA,然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA,實時熒光定量PCR儀進行擴增及熒光定量,實驗操作按照產(chǎn)品說明書進行,采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物序列,見表1。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計處理,統(tǒng)計數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且方差齊,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用LSD檢驗,P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 糖腎寧對KK-Ay小鼠血清肌酐、尿素氮水平的影響

與正常對照組相比,模型組小鼠血清肌酐、尿素氮水平明顯升高(P＜0.05)；與模型組相比,糖腎寧組及纈沙坦組小鼠血清肌酐及尿素氮水平明顯降低(P＜0.05)。提示糖腎寧能夠明顯降低KKAy小鼠血清肌酐、尿素氮水平。見表2。

表2 各組小鼠血清肌酐及尿素氮水平比較(±s)

表2 各組小鼠血清肌酐及尿素氮水平比較(±s)

注：與正常對照組相比,aP＜0.05；與模型組相比,bP＜0.05。

組別 鼠數(shù) 肌酐(μmol/L) 尿素氮(mmol/L)正常對照組10 16.86±4.02 8.79±1.58模型組 10 30.93±6.16a 14.88±3.30a糖腎寧組 10 21.20±3.37b 11.47±2.44b纈沙坦組 10 21.56±3.93b 11.58±2.60b

2.2 糖腎寧對KK-Ay小鼠腎小球細胞外基質(zhì)增生的影響

使用PAS染色觀察各組小鼠腎組織細胞外基質(zhì)增生情況。與正常對照組相比,模型組小鼠腎小球肥大,細胞外基質(zhì)出現(xiàn)增生；與模型組相比,糖腎寧組及纈沙坦組小鼠腎小球減小,細胞外基質(zhì)增生減輕。提示糖腎寧能夠減輕KK-Ay小鼠腎小球細胞外基質(zhì)增生。見圖1。

圖1 各組小鼠腎小球細胞外基質(zhì)增生比較(×400)

2.3 糖腎寧對KK-Ay小鼠腎小球細胞外基質(zhì)蛋白Collagen I及FN蛋白表達的影響

應(yīng)用免疫組化檢測各組小鼠腎組織細胞外基質(zhì)蛋白Collagen I及FN蛋白表達情況。與正常對照組相比,模型組小鼠腎小球細胞外基質(zhì)蛋白Collagen I及FN蛋白表達明顯增加；與模型組相比,糖腎寧組及纈沙坦組小鼠Collagen I及FN蛋白表達明顯減少。提示糖腎寧能夠減少KK-Ay小鼠腎小球細胞外基質(zhì)蛋白Collagen I及FN蛋白表達。見圖2、表3。

圖2 各組小鼠腎小球Collagen I蛋白(A)及FN蛋白(B)水平比(×400)

表3 各組小鼠腎組織Collagen I及FN蛋白表達水平比較(±s)

表3 各組小鼠腎組織Collagen I及FN蛋白表達水平比較(±s)

注：與正常對照組相比,aP＜0.05；與模型組相比,bP＜0.05。

組別 鼠數(shù) Collagen I蛋白(IOD)FN蛋白(IOD)正常對照組10 19.75±7.68 34.21±6.68模型組 10 270.73±23.33a 112.49±20.92a糖腎寧組 10 120.27±18.63b 74.46±9.56b纈沙坦組 10 150.07±23.61b 64.05±10.21b

2.4 糖腎寧對KK-Ay小鼠足細胞EMT標志蛋白P-cadherin及FSP-1蛋白表達的影響

應(yīng)用WB檢測各組小鼠腎組織P-cadherin蛋白及FSP-1蛋白表達情況。實驗結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組小鼠腎組織P-cadherin蛋白表達明顯下調(diào)(P＜0.05),FSP-1蛋白表達明顯上調(diào)(P＜0.05)；與模型組相比,糖腎寧組及纈沙坦組小鼠腎組織P-cadherin蛋白表達明顯上調(diào)(P＜0.05),FSP-1蛋白表達明顯下調(diào)(P＜0.05)。實驗結(jié)果表明,糖腎寧能夠上調(diào)KK-Ay小鼠足細胞表型標志蛋白P-cadherin表達,下調(diào)間充質(zhì)表型標志蛋白FSP-1蛋白表達。見圖3、表4。

圖3 各組小鼠腎組織P-cadherin蛋白及FSP-1蛋白水平比較

表4 各組小鼠腎組織P-cadherin及FSP-1蛋白表達水平比較(±s)

表4 各組小鼠腎組織P-cadherin及FSP-1蛋白表達水平比較(±s)

注：與正常對照組相比,aP＜0.05；與模型組相比,bP＜0.05。

組別 鼠數(shù) P-cadherin蛋白(灰度值)FSP-1蛋白(灰度值)正常對照組4 1070.86±138.92 477.12±74.97模型組 4 218.93±65.84a 1336.38±193.72a糖腎寧組 4 565.43±87.71b 692.44±99.23b纈沙坦組 4 750.94±96.19b 703.29±98.52b

2.5 糖腎寧對KK-Ay小鼠足細胞EMT標志蛋白P-cadherin及FSP-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

應(yīng)用RT-PCR檢測各組小鼠腎組織P-cadherin及FSP-1的mRNA表達情況。實驗結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組小鼠腎組織P-cadherin的mRNA表達明顯下調(diào)(P＜0.05),FSP-1的mRNA表達明顯上調(diào)(P＜0.05)；與模型組相比,糖腎寧組及纈沙坦組小鼠腎組織P-cadherin的mRNA表達明顯上調(diào)(P＜0.05),FSP-1的 mRNA表達明顯下調(diào)(P＜0.05)。提示糖腎寧能夠上調(diào)KK-Ay小鼠足細胞表型標志蛋白P-cadherin的mRNA表達,下調(diào)間充質(zhì)表型標志蛋白FSP-1的mRNA表達。見表5。

表5 各組小鼠腎組織P-cadherin及FSP-1的mRNA表達水平比較(±s)

表5 各組小鼠腎組織P-cadherin及FSP-1的mRNA表達水平比較(±s)

注：與正常對照組相比,aP＜0.05；與模型組相比,bP＜0.05。

P-cadherin mRNA FSP-1 mRNA正常對照組組別 鼠數(shù)5 1.03±0.04 1.04±0.06模型組 5 0.26±0.05a 1.83±0.08a糖腎寧組 5 0.78±0.07b 1.36±0.04b纈沙坦組 5 0.74±0.05b 1.38±0.04b

3 討論

DN的發(fā)病率逐年升高,已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康和生命的重大疾病。DN是歐美發(fā)達國家終末期腎臟病的首要病因[1],在中國DN導致終末期腎臟病的比例也越來越高[2]。研究發(fā)現(xiàn),DN腎小球Collagen I及FN等基質(zhì)蛋白明顯增加,而腎小球細胞外基質(zhì)增生是DN特征性的病理改變[3]。腎小球細胞外基質(zhì)增生會引起腎臟結(jié)構(gòu)及功能異常,導致蛋白尿的產(chǎn)生及腎小球硬化。因此減輕腎小球細胞外基質(zhì)增生可以有效地延緩DN疾病的進展。足細胞EMT在DN腎小球細胞外基質(zhì)增生過程中發(fā)揮著重要作用[4]。足細胞是一種腎小球上皮細胞,但當受到轉(zhuǎn)化生長因子-β、高糖等損傷性刺激時會啟動EMT的過程。足細胞EMT時其上皮細胞標志蛋白P-cadherin會向N-cadherin轉(zhuǎn)變,并且會特異性的表達FSP-1蛋白[7]。此外足細胞會發(fā)生一系列表型改變,如細胞骨架重構(gòu)、足突融合消失,細胞間連接破壞、裂孔隔膜消失,紡錘形的細胞形態(tài)消失,轉(zhuǎn)變?yōu)轾Z卵石形狀[8]。最終足細胞會轉(zhuǎn)變成為肌成纖維細胞,特異性地分泌Collagen I及FN等基質(zhì)蛋白,引起腎小球細胞外基質(zhì)增多及腎小球硬化。做足細胞EMT介導的腎小球細胞外基質(zhì)增生是DN的重要病理機制,但是目前卻缺少針對性的治療措施。

中醫(yī)藥在DN防治方面具有獨特的優(yōu)勢,并且顯示出其多靶點效應(yīng)。DN病程長,在不同的疾病階段其中醫(yī)病因病機也有所不同,應(yīng)分期論治。筆者根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗認為：DN早期病位主要在肝腎,主要病機為肝腎氣陰兩虛、腎絡(luò)瘀滯；中期病位主要在脾腎,主要病機為脾腎氣陽兩虛、腎絡(luò)瘀阻；晚期病位主要在腎、肝、脾三臟,主要病機為氣血陰陽衰敗、濁毒內(nèi)停、腎絡(luò)瘀結(jié)[9]。針對DN早期的病機,運用益氣養(yǎng)陰、化瘀散結(jié)法進行治療。糖腎寧是在益氣養(yǎng)陰、化瘀散結(jié)的治則指導下研制的中藥制劑,臨床實驗證實,糖腎寧具有降低DN早期患者蛋白尿、改善腎功能的作用[10]。此外基礎(chǔ)實驗證實,糖腎寧可以上調(diào)DN足細胞Nephrin蛋白表達、減輕足細胞損傷[11]。

本實驗觀察了糖腎寧對KK-Ay小鼠血清肌酐、尿素氮水平的影響,提示糖腎寧能夠降低KK-Ay小鼠血清肌酐、尿素氮水平,下調(diào)KK-Ay小鼠腎小球基質(zhì)蛋白表達,減輕細胞外基質(zhì)增生,上調(diào)KK-Ay小鼠足細胞P-cadherin蛋白表達,下調(diào)FSP-1蛋白表達。本研究結(jié)果表明,糖腎寧能夠抑制DN小鼠足細胞EMT,減輕腎小球細胞外基質(zhì)增生,但其抑制DN足細胞EMT的具體分子機制有待進一步研究。