劉寶山，李珮瑤，許莉莉，高晶萍，張瑞華，徐 彤

(1.灤平縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 灤平 068250； 2.河北北方學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000)

鵝細(xì)小病毒病是由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus,GPV)引起的可在鵝和番鴨中流行的急性或亞急性敗血性傳染病，又稱小鵝瘟[1]，主要侵害4～20日齡雛鵝或雛番鴨。該病傳播速度快且病死率高，其特征性病理變化為空腸和回腸的纖維素性壞死性腸炎，壞死脫落的腸黏膜與凝固的纖維素性滲出物形成栓子堵塞腸道[2]。GPV最早由我國(guó)學(xué)者方定一在江蘇地區(qū)發(fā)現(xiàn)[3]，隨后迅速傳播到全國(guó)各地。小鵝瘟是鵝養(yǎng)殖業(yè)中不可忽視的傳染病，每年都有不同程度的流行，給鵝養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

承德白鵝是經(jīng)多年選育形成的地方優(yōu)良品種，在河北承德地區(qū)均有飼養(yǎng)。承德白鵝是中小型品種鵝，適應(yīng)性強(qiáng)，耐寒耐粗飼，抗病性強(qiáng)，其肉質(zhì)鮮嫩，適口性好，并且蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低，對(duì)人體健康十分有益[4-5]。承德白鵝主要由當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶散養(yǎng)，因缺乏防疫和品種保護(hù)意識(shí)，鵝的數(shù)量減少，養(yǎng)殖效益受損。

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人們生活水平的提高，人們對(duì)飲食健康的要求越來(lái)越高，禽產(chǎn)品在飲食結(jié)構(gòu)中占比例越來(lái)越大。GPV感染雛鵝導(dǎo)致的死亡率高達(dá)90%～100%[6]，成為承德白鵝養(yǎng)殖和繁育中的巨大威脅。2018年7月，承德某農(nóng)戶家中飼養(yǎng)的10日齡雛鵝出現(xiàn)大量死亡。對(duì)該農(nóng)戶家中疑似GPV感染發(fā)病的承德白鵝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷、病毒的分離鑒定及致病特性研究，以期為日后承德白鵝小鵝瘟的防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料及供試動(dòng)物 疑似GPV感染的病料由河北承德某農(nóng)戶提供；鵝胚購(gòu)于張家口市某農(nóng)戶；6日齡雛鵝由河北北方學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行孵化。

1.1.2 主要試劑 GPV標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗體均購(gòu)自上海莼試生物技術(shù)有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；聚乙二醇6000購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；TIANamp Genomic DNA Kit、TIANgel Midi Purification Kit等均購(gòu)自天根生化科技有限公司；RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、Taq、DL2000 Marker等均購(gòu)自TaKaRa(大連) 有限公司；50×TAE 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；乙醇、氯仿、異丙醇等均購(gòu)自天津光復(fù)精細(xì)化學(xué)研究所有限公司。

1.2 方法

1.2.1 背景調(diào)查 2018年7月，承德某農(nóng)戶家中孵化的承德白鵝出現(xiàn)大量死亡。據(jù)該農(nóng)戶敘述，自行孵化的承德白鵝在孵化后3 d開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡、不愿走動(dòng)、食欲不振、飲水增加，5～7 d出現(xiàn)大量死亡，臨床可見(jiàn)病鵝排水樣白色稀糞、泄殖腔周圍被毛被糞便污染、鼻孔內(nèi)有漿液性黏液、喙部呈暗紫色，剖檢可見(jiàn)肝臟腫大變脆，心肌蒼白，在消化道出現(xiàn)小鵝瘟典型癥狀，空腸和回腸的壞死性腸炎，壞死脫落的腸黏膜與纖維素性滲出物形成栓子堵塞腸道。

鑒于上述臨床癥狀和剖檢變化，初步懷疑該病是由GPV感染引起的，為進(jìn)一步確診該病進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。

1.2.2 細(xì)菌分離 無(wú)菌采集發(fā)病鵝的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟等臟器，在超凈工作臺(tái)中接種于普通瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基中，37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)及菌落顏色、形態(tài)等。

1.2.3 病毒分離 采集發(fā)病鵝的心臟、肝臟、腸道等組織，研磨離心，經(jīng)抗生素過(guò)夜處理后過(guò)濾除菌，經(jīng)尿囊腔接種鵝胚，每胚接種0.3 mL，去除24 h內(nèi)死亡鵝胚，觀察120 h，收集鵝胚尿囊液，盲傳3代，將收集的病毒尿囊液備用。

1.2.4 病毒鑒定 將擴(kuò)增的病毒尿囊液純化、濃縮后作為待檢病毒，以GPV標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)鑒定待檢病毒。

1.2.5 致病性試驗(yàn) 將10枚鵝胚隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5枚。鵝胚孵化后飼養(yǎng)至第6天，接種分離的病毒尿囊液，試驗(yàn)組每只肌肉注射0.2 mL尿囊液，對(duì)照組相同途徑注射0.2 mL生理鹽水。將上述雛鵝隔離飼養(yǎng)，觀察其臨床癥狀并統(tǒng)計(jì)死亡情況。

1.2.6 分子特征分析

1.2.6.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已公布的GPV標(biāo)準(zhǔn)株B序列基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物(表1)，擴(kuò)增VP基因，預(yù)計(jì)VP1片段大小1 397 bp，VP2片段大小1 273 bp，引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2.6.2 PCR擴(kuò)增 按照TIANamp Genomic DNA Kit說(shuō)明書提取病毒DNA，采用50 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，Taq0.25 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，用水補(bǔ)至50 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min 20 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，最后4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 VP基因的PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequence of PCR amplification of VP gene

按TIANgel Midi Purification Kit說(shuō)明書進(jìn)行DNA回收，取2 μL回收產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，由華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6.3VP基因序列分析 采用DNAStar軟件將測(cè)得的序列進(jìn)行拼接，獲得完整VP基因序列，用MegAlign秩序進(jìn)行氨基酸同源性的分析，利用MEGA 6.06軟件對(duì)分離到的毒株與GenBank中已公布的其他不同種屬的GPV(表2)進(jìn)行序列比對(duì)分析。

表2 GPV VP基因序列參考毒株相關(guān)信息Tab.2 Reference information of VP gene sequence of GPV

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病鵝細(xì)菌分離普通培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基中均未見(jiàn)有細(xì)菌生長(zhǎng)，表明雛鵝未有細(xì)菌感染。

2.2 發(fā)病鵝病毒分離鑒定接種病料的鵝胚接種110 h后死亡2枚，其余鵝胚未死亡，但尿囊膜增厚、部分有尿酸鹽沉積。將鵝胚解剖后發(fā)現(xiàn)，鵝胚胚體有大量出血點(diǎn)，肝臟呈黃紅色，有血斑及壞死灶，心肌蒼白、腎臟腫脹(圖1)。將上述尿囊液收集濃縮后進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，GPV標(biāo)準(zhǔn)抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗體反應(yīng)后，在24 h出現(xiàn)明顯白色沉淀線，待檢抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗體在28 h出現(xiàn)白色沉淀線，表明分離到的病毒是GPV，將其命名為HB株。

2.3 分離病毒致病性試驗(yàn)試驗(yàn)組在感染后28 h死亡2只，48 h死亡1只，96 h死亡2只，死亡鵝與臨床雛鵝癥狀表現(xiàn)及剖檢變化相似(圖2)，均表現(xiàn)白色下痢、精神萎靡、呆立、不愿行走；剖檢可見(jiàn)肝臟呈黃紅色，腎臟腫大，腸壁變薄，腸道有纖維素性滲出物形成腸道栓塞。

A.腸道栓塞；B.腸壁變薄、出血、白色下?。籆.腎臟腫大；D.肝臟出血A.Intestinal embolism;B.Intestinal wall thinning,bleeding and white diarrhea;C.Kidney enlargement;D.Liver bleeding圖2 感染鵝剖檢變化Fig.2 Necropsy change of infected goose

2.4 分離病毒分子特征分析

2.4.1VP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 根據(jù)設(shè)計(jì)的2對(duì)特異性引物，擴(kuò)增出的2個(gè)片段大小分別約為1 397 bp和1 273 bp，如圖3所示，擴(kuò)增出的片段與目的片段一致。將測(cè)序結(jié)果拼接后得到VP片段長(zhǎng)度為2 475 bp，包含VP1、VP2、VP3等3個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，其大小分別為2 199、1 764、1 605 bp。

M：DL2000 Marker；P1：VP1片段產(chǎn)物；P2：VP2片段產(chǎn)物M: DL2000 Marker;P1:VP1 fragment product;P2:VP2 fragment product圖3 VP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The PCR amplification results of VP gene

2.4.2VP基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 將獲得的VP基因序列與GenBank中已發(fā)表的21株細(xì)小病毒進(jìn)行比較，應(yīng)用MEGA 6.06軟件(NJ法)繪制VP基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)。從圖4可以看出，供試細(xì)小病毒分為GPV、MDPV 2個(gè)大分支，MDPV分支中中國(guó)的GPV D株宿主為番鴨，推測(cè)可能是GPV感染番鴨后在其體內(nèi)發(fā)生變異，故在分群中處于MDPV分支。GPV分為2個(gè)基因亞群，其中Ⅰa群中毒株大多為匈牙利、法國(guó)等歐洲毒株，為歐洲亞群；Ⅰb群為亞洲群，Ⅱ群則主要是疫苗毒株。本研究分離毒株HB株(用●表示)處于Ⅰb亞洲群。

2.4.3VP基因編碼氨基酸相似性 采用DNAStar軟件中MegAlign程序?qū)⒎蛛x毒株HB株與表2中氨基酸序列進(jìn)行相似性比較，結(jié)果如圖5所示，氨基酸相似性在86.7%～99.7%，GPV HB與GPV各毒株VP基因氨基酸相似性在96.6%～99.7%，其中與SHFX1201、Y株的相似性最高，達(dá)99.7%；HB株與MDPV毒株氨基酸差異較大?？梢?jiàn)，GPVVP基因較為穩(wěn)定，氨基酸差異不大。

●表示分離毒株HB株● indicates isolated HB strain圖4 HB株VP基因遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Genetic evolution tree of VP gene of HB strain

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從河北承德地區(qū)的承德白鵝中分離到1株病毒，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離毒株為GPV。致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組6只雛鵝在感染后96 h全部死亡，死亡率為100%，并表現(xiàn)與臨床發(fā)病鵝相似的癥狀和剖檢變化，即肝臟、腎臟、脾臟腫大，腸壁變薄，腸道有纖維素性滲出物形成的腸道栓塞。這與毛文智等[7]、李琳等[8]的研究結(jié)果相似，表明GPV感染是造成此次雛鵝發(fā)生死亡的重要原因。

GPV基因組大小約為5 kb，包含2個(gè)ORF，左側(cè)ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS，右側(cè)ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP，VP基因包含VP1、VP2、VP3等3個(gè)ORF，VP1包含VP2、VP3，他們使用同一終止密碼子；NS主要參與DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，還與病毒的增殖有關(guān)；VP蛋白是GPV的主要免疫保護(hù)性抗原，與病毒毒力和病毒致病性有關(guān)[9]。為進(jìn)一步了解分離毒株HB株的基因變異情況，本研究采用PCR方法對(duì)HB株VP基因進(jìn)行擴(kuò)增。將測(cè)序結(jié)果拼接后得到VP片段長(zhǎng)度為2 475 bp，包含VP1、VP2、VP3等3個(gè)ORF，其大小分別為2 199、1 764、1 605 bp。將VP基因與國(guó)內(nèi)外的GPV毒株進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示分離到的HB株GPV與5株國(guó)內(nèi)分離毒株同處于遺傳進(jìn)化樹(shù)Ⅰb群(亞洲群)；匈牙利、法國(guó)等地流行毒株同處于Ⅰa群(歐洲群)；Ⅱ群則主要是疫苗毒株。由此可見(jiàn)，HB株與GPV國(guó)內(nèi)分離株VP基因之間差異較小，而與國(guó)外分離株結(jié)構(gòu)基因的差異相對(duì)較大。這與孔憲剛等[10]對(duì)中國(guó)分離株HG5/82株VP基因的分子特征分析結(jié)果相同。本研究將以上毒株進(jìn)行了氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，HB株與GPV各毒株VP基因編碼氨基酸相似性在96.6%～99.7%，其中與國(guó)內(nèi)SHFX1201、Y株的氨基酸相似性最高，達(dá)99.7%，表明其VP同源性較高，這與遺傳進(jìn)化分析結(jié)果一致，即目前存在的GPV分離株的遺傳關(guān)系較近[11-13]。劉中勇等[14]對(duì)7株鵝細(xì)小病毒進(jìn)行了克隆擴(kuò)增并將其與標(biāo)準(zhǔn)毒株B株進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)目前國(guó)內(nèi)的GPV相似性較高，但強(qiáng)弱毒株之間存在一些差異，以上結(jié)果也驗(yàn)證了GPV只有1個(gè)血清型的觀點(diǎn)[11-12,15]。

GPV與MDPV同屬于細(xì)小病毒屬，兩者在病毒大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)、理化特征及免疫學(xué)特性上極為相似[2,16]。程由銓等[17]發(fā)現(xiàn)，GPV與MDPV在血清學(xué)檢測(cè)時(shí)不發(fā)生交叉反應(yīng)，推測(cè)兩者在抗原性上存在差異。因此，研究GPV與MDPV核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的差異性，可為進(jìn)一步研究?jī)烧呖乖圆町惡退拗鞲腥痉秶峁┗A(chǔ)。本研究將分離的HB株與3株MDPV進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析和推導(dǎo)氨基酸序列分析，結(jié)果顯示，VP基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分為GPV和MDPV 2支，HB株與MDPV毒株氨基酸差異較大。以上結(jié)果表明，GPV與MDPV之間存在較近的遺傳關(guān)系，兩者可能是由同一種病毒在不同宿主體內(nèi)長(zhǎng)期適應(yīng)的結(jié)果。

經(jīng)過(guò)病毒分離鑒定、致病性研究和VP基因擴(kuò)增，可確定此次承德白鵝的死亡是由GPV感染造成的。本研究對(duì)分離毒株的VP基因進(jìn)行分子特征分析發(fā)現(xiàn)，分離到的HB株與其他GPV毒株遺傳關(guān)系較近，證實(shí)GPV只有1個(gè)血清型。