馮嘉昆 綜述 李正發(fā) 審校

1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650504；2.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院/云南省第一人民醫(yī)院，云南 昆明 650032

慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是骨髓造血干細(xì)胞惡性克隆性增生形成的血液系統(tǒng)腫瘤，90%以上CML 患者t(9；22)(q34；q11)易位形成BCR-ABL 融合基因為主要發(fā)病特征。其BCR-ABL 融合基因表達(dá)的致癌性蛋白(p210)具有酪氨酸激酶活性，該激酶活性改變了細(xì)胞內(nèi)正常的信號通路傳導(dǎo)，并抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。一代酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼(imatinib，mesylate，IM)能靶向抑制p210酪氨酸激酶活性，是治療CML的首選藥物[1]。然而隨著酪氨酸激酶抑制劑問世，其盡管療效令人滿意但仍有20%的患者用藥后出現(xiàn)不敏感及耐藥情況，分別稱為原發(fā)性耐藥或獲得性耐藥。此外，少數(shù)患者對IM不耐受，表現(xiàn)為嘔吐、肌無力、血細(xì)胞減少[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在CML 患者BCR-ABL 融合基因陽性的骨髓樣本中發(fā)現(xiàn)PML高表達(dá)，提示TKI耐藥的白血病細(xì)胞是導(dǎo)致疾病耐藥、復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素且PML可能與白血病耐藥或急變有密切關(guān)系[3]。本文就PML 在CML細(xì)胞中的表達(dá)意義進(jìn)行綜述。

1 PML 基因

PML 基因最早在急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)中被發(fā)現(xiàn)，因染色體特征性的t(15，17)易位形成了PML-RARα融合基因，從而造成造血干/祖細(xì)胞在早幼粒細(xì)胞階段分化受阻而獲得自我更新的能力，成為APL發(fā)病主要機制[4]。該基因全長53 Kb，位于第15號染色體上，C末端外顯子通過可變剪接后形成六種核型結(jié)構(gòu)和一種胞質(zhì)型結(jié)構(gòu)[5]。其中，一種定位于核基質(zhì)的多蛋白復(fù)合體稱為PML 核體(PML-NBs)[6]，具有促細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤發(fā)生等生物學(xué)功能。N 末端418 個氨基酸是所有同種型共有序列，包含RING(R)、B-Boxl(B1)、B-Boxl(B2)和卷曲螺旋(CC)結(jié)構(gòu)域，總稱為RBCC 或三聯(lián)基序(TRIM)結(jié)構(gòu)域[7-8]。超過120 種蛋白質(zhì)與PML 相互作用介導(dǎo)了PML 在細(xì)胞中的生命活動，如BCL-2、UBC、STAT3等[9]。由于PML核體具有多種生物學(xué)功能成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點，但目前國內(nèi)外的研究主要集中于PML核體在實體瘤的發(fā)生及治療中的新發(fā)現(xiàn)，而在非APL髓系白血病的研究相對較少。

2 PML在造血干細(xì)胞以及慢性髓系白血病的調(diào)節(jié)作用

2.1 PML 在造血干細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用 與磷酸酶和張力素同源酶(PTEN)類似，PML通過多種水平負(fù)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路，其中PML-NBs 募集AKT 磷酸酶PP2a 和磷酸化AKT 后共定位于核內(nèi)，使磷酸化AKT失活從而達(dá)到抑癌作用。ITO等[3]研究發(fā)現(xiàn)，PML 高表達(dá)于造血干細(xì)胞中，但其與造血干細(xì)胞分化程度呈負(fù)相關(guān)。敲除后的PML-/-小鼠骨髓中的造血干細(xì)胞數(shù)顯著少于野生型小鼠，提示PML可能與造血干細(xì)胞增殖有著密切聯(lián)系。

2.2 PML在慢性髓系白血病中的表達(dá)與作用 ITO等[3]，基于PML 對造血干細(xì)胞維持具有關(guān)鍵作用的這一假設(shè)成立，深入研究發(fā)現(xiàn)在80 例CML 患者慢性期標(biāo)本中PML 基因表達(dá)水平較高；且與低表達(dá)患者相比，低表達(dá)患者分子遺傳學(xué)緩解率更優(yōu)預(yù)示著臨床療效更佳；提示PML可能與CML發(fā)展、患者預(yù)后有著緊密聯(lián)系。在對CML疾病模型分析時也支持這一觀點，敲除PML 后的白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells，LICs)克隆形成能力降低，最終消耗殆盡。CML 白血病細(xì)胞可能通過PML-PTEN 信號通路維持細(xì)胞存活。PTEN 是最常見的腫瘤抑制因子之一[10-11]，PTEN通常定位于細(xì)胞核和胞漿中，在細(xì)胞核內(nèi)定位的能力對于維持基因組的穩(wěn)定性和抑制生長是必不可少的。相關(guān)研究指出，在許多癌癥標(biāo)本中PTEN 核定位是經(jīng)常性丟失的[12]。腫瘤抑制因子PTEN受皰疹病毒相關(guān)泛素特異性蛋白酶(HAUSP 或稱USP7)的負(fù)調(diào)控，而HAUSP具有調(diào)節(jié)p53的抑癌功能。SONG等[13]研究報道，PTEN核質(zhì)穿梭受到HAUSP的去泛素化調(diào)控。HAUSP 使PTEN 去泛素化，HAUSP 則受到PML負(fù)調(diào)控[14]。MOROTTI等[15]在對BCR-ABL陽性的造血祖母細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，PML低水平表達(dá)時，HAUSP活性增高并使PTEN 去泛素化，PTEN 發(fā)生核排斥，使造血祖母細(xì)胞增殖。且指出BCR-ABL是直接通過酪氨酸激酶活性使HAUSP 磷酸化，導(dǎo)致PTEN 的核排斥，CML造血祖細(xì)胞獲得異常增殖優(yōu)勢。在對CML干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的PML 抵消了BCR-ABL 對PTEN 的核排斥作用，致使PTEN 在細(xì)胞核中積累，最終維持CML干細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)，這種狀態(tài)維持白血病細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性是所必須的。應(yīng)用AS2O3聯(lián)合IM 處理CML 干細(xì)胞后PML 降解，促使CML 干細(xì)胞對IM 敏感?？傊?，PML 介導(dǎo)HAUSP 負(fù)調(diào)控，支持PTEN 核定位，BCR-ABL 則與PML 功能相反，以促進(jìn)PTEN 核排斥(圖1)。

圖1 PML-PTEN信號通路圖

最新研究報道，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的PML 調(diào)節(jié)其促炎因子對于維持CML細(xì)胞增殖具有一定作用[16-18]。GUARNERIO等[19]將BCR-ABL 陽 性 的CML 與MSCs (PML-/-)、MSCs(PML+/+)體外共培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)與MSCs(PML+/+)共培養(yǎng)時白血病細(xì)胞數(shù)量有明顯增多。提示MSCs(PML+/+)可能具有維持白血病細(xì)胞作用。后經(jīng)AS2O3處理的CML 細(xì)胞與MSCs(PML+/+)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞與未處理組比較數(shù)量明顯減少。其次PML 調(diào)控趨化因子CXCL1和IL-6在白血病的發(fā)展過程中也起著重要的作用。在白血病患者血清樣本中發(fā)現(xiàn)CXCL1和IL-6水平高于對照組，提示將這兩種細(xì)胞因子作為其他細(xì)胞因子或其受體的靶點，可能與聯(lián)合常規(guī)化療治療的白血病患者帶來良好預(yù)后[20]。該研究提示，在CML 中，BCR/ABL 控制IL-6 的表達(dá)，并通過IL-6建立旁分泌環(huán)，進(jìn)而維持白血病細(xì)胞。但PML的靶向降解或選擇性抑制PML誘導(dǎo)的因子(如：IL-6)，是否有助于根除CML的微小殘留病灶，以及是否可能通過增高IL-6水平使細(xì)胞凋亡途徑受限，使白血病細(xì)胞維持靜止態(tài)，還需進(jìn)一步研究驗證。

臨床研究中，發(fā)現(xiàn)一例78 歲男性患者初診為CML 經(jīng)服IM6 個月后因頭昏及易疲勞遂改服達(dá)沙替尼(二代酪氨酸酶抑制劑)。由于患者無定期隨訪史，7年后復(fù)查報告顯示原始細(xì)胞占2%、早幼粒細(xì)胞占18%，應(yīng)用熒光原位雜交分析發(fā)現(xiàn)BCR-ABL融合蛋白(P210)與PML-RARα融合蛋白拷貝數(shù)相當(dāng)，分別為48.25 和46.44，已達(dá)中度風(fēng)險的APL 診斷標(biāo)準(zhǔn)。隨后給予維甲酸和AS2O3治療，復(fù)查融合蛋白轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)BCR-ABL 融合蛋白(p210)和PML-RARα表達(dá)水平明顯減少[21]。該研究提示，PML 在IM 治療的CML 患者中可能伴隨疾病發(fā)展。雖然這類病例目前少有報道，但隨著酪氨酸激酶抑制劑與化療藥物的使用，CML 患者繼而發(fā)生耐藥情況。耐藥白血病細(xì)胞可能通過PML介導(dǎo)的信號通路維持生存，但調(diào)控分子機制尚未完全了解。

3 針對PML治療對策探索

3.1 砷劑治療PML-RARα(+)APL、CML 砷在傳統(tǒng)中醫(yī)用藥已有兩千多年的歷史，我國研究人員最初使用AS2O3和氯化汞溶液治療急性和慢性白血病患者，隨后報道了APL患者成功治愈，并指出使用AS2O3對APL 細(xì)胞呈劑量依賴性?？茖W(xué)家們進(jìn)一步深入研究證明[22]，砷的治療效果是由于其對融合蛋白PML-RARα中的PML 部分起作用，砷與PML 蛋白B2結(jié)構(gòu)域中的兩個半胱氨酸殘基結(jié)合，誘導(dǎo)氧化導(dǎo)致二硫鍵形成，并使PML發(fā)生小泛素化相關(guān)修飾(SUMO)，并引起環(huán)指蛋白4 (RNF4，是一種泛素連接酶)聚集，最后形成的泛素化PML-RARα復(fù)合物將通過泛素-蛋白酶體途徑被降解[23-24]。針對CML確診治療后，建議定期監(jiān)測PML-RARα融合。發(fā)生PML-RARα融合的患者，治療上采取全反式維甲酸和AS2O3可達(dá)到形態(tài)學(xué)緩解[21]。隨著藥物靶向抑制癌基因的發(fā)展，AS2O3消除腫瘤細(xì)胞受到廣泛青睞。但據(jù)報道，AS2O3的毒副作用較大可引起白血病患者骨髓抑制、肝功能障礙、胃腸紊亂以及對心臟等的毒副作用[25-28]。

3.2 藥用植物活性成分誘導(dǎo)PML-RARα(+)APL細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展 MALIHEH等[29]利用西紅花素誘導(dǎo)急性APL 細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)西紅花素能使PML-RARα融合基因表達(dá)下調(diào)，并通過BAX/BCL2途徑使白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。鄧守恒等[30]研究提示，硒化殼聚糖處理NB4 細(xì)胞時降低PML-RARα融合蛋白含量并抑制細(xì)胞增殖。陳銘陽等[31]在對龜甲中潛在藥理活性的miRNA 研究中通過靶基因預(yù)測結(jié)果顯示一條取名為xtr-miR-22的miRNA可作用于PML基因的表達(dá)，預(yù)示著其潛在治療早幼粒細(xì)胞白血病的藥理活性。吳迪炯等[32]利用苦參堿聯(lián)合全反式維甲酸處理耐藥的NB4細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞獲得再分化的能力，同時降低PML-RARα融合蛋白的含量。朱紅青等[33]研究發(fā)現(xiàn)利用葛根總黃酮體外能誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株NB4 凋亡。楊雷等[34]利用丹參酮ⅡA 治療耐AS2O3和全反式維甲酸治療APL，白血病患者使用丹參酮ⅡA治療后骨髓形態(tài)學(xué)達(dá)到完全緩解；此外，丹參酮ⅡA還能促進(jìn)CML細(xì)胞凋亡[35]。綜上，中藥活性成分作為當(dāng)前腫瘤治療的重要途徑之一。大量藥理學(xué)研究證明，其具有多成分、多靶點干預(yù)、副作用低等優(yōu)勢，但中藥針對PML靶基因抑制的開發(fā)具有潛在巨大價值。

4 結(jié)語

PML在DNA損傷反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、衰老和血管生成等執(zhí)行著多種生物學(xué)功能。進(jìn)一步研究表明，PML在CML 細(xì)胞維持中具有重要意義；PML 可能通過PML-PTEN 通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生存。盡管經(jīng)IM 治療的CML患者出現(xiàn)PML-RARα融合及早幼粒細(xì)胞爆發(fā)現(xiàn)象比較罕見，但這種現(xiàn)象是因IM治療后獲得還是伴隨CML疾病發(fā)展出現(xiàn)，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。新的治療方法可能針對PML，用以靶向下調(diào)PML表達(dá)或使腫瘤干細(xì)胞消耗殆盡。無論是在正常還是病理條件下，進(jìn)一步研究PML及其相關(guān)通路都可能提供更多的藥物靶點，并將有助于治療慢性髓系白血病開辟新道路。

早期藥理研究中指出利用AS2O促成PML蛋白降解，但據(jù)相關(guān)報道分別指出AS2O3造成機體肝臟、心臟損害的毒性是不可忽略的，因此尋找新藥代替AS2O3或聯(lián)合化療藥物、酪氨酸抑制劑使用靶向下調(diào)PML 基因的表達(dá)是必要的。部分研究已證明中藥活性有效成分可抑制PML-RARα融合基因/蛋白的表達(dá)[36-37]，但是否通過靶向作用于PML 基因及其作用機制則需通過實驗進(jìn)一步證明。隨著中醫(yī)理論與血液腫瘤的關(guān)系不斷的深入，通過中醫(yī)藥手段來降低患者的放化療毒副作用及復(fù)發(fā)率，提高腫瘤患者的生存率，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。