李婉芬, 王 璐, 謝詠琳, 方 琳, 毛文慧, 林倩琦, 林健邦, 王寶珍

大腸埃希菌是一種在腸道分布廣泛的細(xì)菌亦是條件致病菌，大部分類型對人體無害，但有些型可致病，若人體內(nèi)的大腸埃希菌含有耐藥基因，可在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)移到人類已適應(yīng)的細(xì)菌或病原體中，這會延長疾病的時間和增加相關(guān)治療的失敗率。近年來，食用動物特別是肉雞和水源的細(xì)菌中分離出大腸埃希菌菌株數(shù)量有上升趨勢[1]。故本研究對澳門地區(qū)市售雞源性產(chǎn)品中產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的分離、鑒定及耐藥基因型進(jìn)行分析，為澳門地區(qū)雞源性產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的分布及其基因型分析提供可靠數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑 瓊脂糖(MERCK)，Luria-Bertani培養(yǎng)液(DIFCO)，麥康氏培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)公司)，胰胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)公司)，Müller-Hinton瓊脂(BD)，胰胨大豆瓊脂培養(yǎng)液(BD)，EC-MUG培養(yǎng)液(BD)，瓷珠菌種保存管(南京歐克生物技術(shù)公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(QIAprep)，頭孢噻肟(Cefotaxime, CTX)，頭孢他啶(Ceftazidime, CAZ)，克拉維酸(Clavulanic Acid, CA)，多聚酶鏈反應(yīng)混合液(碧云天生物技術(shù)公司)，PCR引物(生工生物工程公司)，TE緩沖液(生工生物工程)，UView Dye和無菌水(BIO-RAD)，DNA分子尺(上海捷瑞生物工程公司)，PstI酶(BBI)，PvuII酶(BBI)。

1.2儀器 Vitek2(Biomerieux),GeneAmp核酸擴增儀和NanoDrop分光亮度計(Thermo)，多重?zé)晒饫涔庥跋裣到y(tǒng)，電泳儀和電泳供電器(BIO-RAD)，水浴箱(Julabo)，超純水儀(Merck)，高溫高壓滅菌爐(HIRAYAMA)，臺式離心機(Labnet)。

1.3樣本來源 自2017年10月至2018年4月，以方便抽樣方式購買澳門地區(qū)巿售的不同批次、品種、農(nóng)場及加工廠，并在保質(zhì)期當(dāng)中的69個雞源性產(chǎn)品。根據(jù)GB2707-2016《鮮(凍)畜、禽產(chǎn)品》[2]來定義樣本，且按照GB/T9695. 19-2008《肉與肉制品取樣方法》[3]和GB4789.1-2016《食品微生物學(xué)檢驗總則》[4]進(jìn)行樣本的收集、貯存和運送。

1.4 菌株來源

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)菌株 本次研究中使用到的標(biāo)準(zhǔn)菌株有大腸埃希菌(ATCC 25922)和肺炎克雷伯氏菌(ATCC 700603)。

1.4.2樣本菌株 參照GB16869-2005《鮮、凍禽產(chǎn)品》[5]的樣本抽取和檢驗流程，以無菌方式稱取25 g樣本，加入225 mL緩沖蛋白胨水，振蕩30 s后，從中吸取30 mL液體至無菌管中，并于44.5 ℃培養(yǎng)18～22 h。參照GB/T5750.12-2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法微生物指標(biāo)》[6]中大腸埃希菌的鑒定方法，及美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會CLSI M100 (2017)[7]的標(biāo)準(zhǔn)，取10 μL增菌后的緩沖蛋白胨水涂抹在含1 mg/L CTX的麥康氏培養(yǎng)基上，44.5 ℃培養(yǎng)18～22 h。挑取可疑菌落3～5株，接種在胰胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上做純培養(yǎng)。把細(xì)菌接種到EC-MUG培養(yǎng)液，于44.5 ℃培養(yǎng)18～22 h后，在366 nm紫外燈下產(chǎn)生藍(lán)白色熒光，且產(chǎn)氣的為陽性菌株，進(jìn)行Vitek2的生化鑒定。

1.5 菌株藥敏試驗及基因分型

1.5.1藥敏試驗及ESBL篩選與確認(rèn)試驗 參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會CLSI推薦的紙片擴散法(K-B法)[7]進(jìn)行; ESBL初篩試驗，將待測菌液用均勻涂布于M-H 平板，貼上抗生素紙片頭孢他啶(CAZ 30 μg)和頭孢噻肟(CTX 30 μg)，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測定抑菌圈的直徑，判斷依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)值。

確定試驗是采用CLSI的酶抑制劑增強雙紙片擴散法[7]。先將待測菌株配成0.5 麥?zhǔn)蠞岫染?，均勻涂布于M-H 平板， 取頭孢他啶(CAZ 30 μg)、頭孢噻肟(CTX 30 μg)、頭孢他啶/克拉維酸(CAC，30/10 μg)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTC，30/10 μg)，35 ℃培養(yǎng)18～24 h；若單藥紙片(CAZ、CTX)與相應(yīng)的紙片(CAC、CTC )中任何一對的抑菌環(huán)直徑之差≥5 mm， 即確認(rèn)該菌株為ESBL 耐藥株。

1.5.2菌株保存 用瓷珠菌種保存管將菌株存儲于-20 ℃的環(huán)境中。

1.5.3質(zhì)粒提取 用質(zhì)粒提取試劑盒對菌株中質(zhì)粒進(jìn)行提取，并用NanoDrop分光亮度計進(jìn)行檢測以確保有提取的質(zhì)粒濃度達(dá)標(biāo)，將提取好的質(zhì)粒存放于-20 ℃環(huán)境中。

1.5.4基因分型 分別用CTX-M、TEM、OXA和SHV這4種不同的引物對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的質(zhì)粒進(jìn)行擴增，并配以陽性對照、陰性對照及空白對照，反應(yīng)條件參照參考資料[8-10]，引物序列參照表1。

1.5.5初步分群 用RFLP的方法對CTX-M的PCR擴增產(chǎn)物用PstI和PvuII進(jìn)行切割，反應(yīng)條件參照參考文獻(xiàn)[8]，之后將其電泳結(jié)果與文獻(xiàn)[8]進(jìn)行對比，從而完成CTX-M分群。

表1 基因引物序列及擴增片段長度Tab.1 Primer sequences of genes and amplicon size

2 結(jié) 果

2.1產(chǎn)ESBLs菌株檢測結(jié)果 69個雞源性產(chǎn)品中有62個產(chǎn)品檢測出了產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，共分離出103株。

2.2產(chǎn)ESBLs基因分型結(jié)果 103株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中，同一產(chǎn)品檢出基因型完全相同的菌株, 視為來自同一克隆, 最后非重復(fù)株有84株，其中CTX-M型、TEM型、OXA型和SHV型檢出率分別為98.8%(83/84)、25.0%(21/84)、3.6%(3/84)和0.0%(0/84)；其中23.80%(20/84)同時攜帶CTX-M型和TEM型，3.6%(3/84)同時攜帶CTX-M型和OXA型。ESBLs 4種分型PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1；菌株得出ESBLs分型PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。

2.3初步分群結(jié)果 83株CTX-M型的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中66.3%(55/83)為CTX-M-G1，31.3%(26/83)為CTX-M-G9，CTX-M-G2和CTX-M-G8的檢出率均為1.2%(1/83)。部分CTX-M型分群酶切后電泳結(jié)果，見圖3。綜合84個非重復(fù)菌株基因分型結(jié)果見表2。

M為100 bp DNA Marker；1為CTX-M；2為 TEM；3為OXA；4為SHV(Klebsiella pneumoniae ATCC 700603)圖1 4種基因分型PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Genotypes of four types ESBLs

M為100 bp DNA Marker；1為CTX-M；2為TEM；3為OXA圖2 菌株得出ESBLs分型PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 PCR results of ESBLs isolates

2.4藥敏試驗 84個非重復(fù)株對12種測試藥物的耐藥情況結(jié)果見圖4。對氨芐西林耐藥率最高達(dá)98.8%(83/84), 其次為四環(huán)素83.3%(70/84)和阿米卡星78.6%(66/84), 碳青霉烯類的亞胺培南和美羅培南均未出現(xiàn)耐藥情況。對第三代頭孢菌素的耐藥程度不一, 其中以頭孢噻肟最高38.1%(32/84), 頭孢曲松次之34.5%(29/84), 而頭孢他啶最低10.7%(9/84)。 對4種以上抗生素的耐藥菌株占83.3%(70/84), 多重耐藥情況嚴(yán)重。

M為100 bp DNA Marker；1為 CTX-M-G1；2為 CTX-M-G2；3為 CTX-M-G8；4為CTX-M-G9。圖3 部分CTX-M型分群酶切后電泳結(jié)果Fig.3 RFLP result of CTX-M positive isolates

表2 84株產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌菌株基因分型檢測結(jié)果(n=84)Tab.2 Genotype of 84 isolates ESBLs producing E.coli

注: AMP為氨芐西林; CTX為頭孢噻肟; CAZ為頭孢他啶; CRO為頭孢曲松; FOX為頭孢西丁; GEN為慶大霉素; AMK為阿米卡星; CIP為環(huán)丙沙星; TCY為四環(huán)素; TZP為哌拉西林; IMP為亞胺培南; MEM為美羅培南圖4 雞源大腸埃希菌菌株對藥物的耐藥率Fig.4 Antibiotic susceptibility patterns of Escherichia coli isolates from chicken

3 討 論

本研究通過藥敏試驗的方式對雞源性產(chǎn)品中產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示出澳門地區(qū)雞源性產(chǎn)品中ESBLs占比高達(dá)89.8%(62/69)，相比中國其他地區(qū)，如哈爾濱79.6%[11]、青島83.1%[12]、河南62.8%[13]及香港72.0%[14]，澳門地區(qū)的檢出率最高，可能因為這些雞源性產(chǎn)品是用集中屠宰的方式進(jìn)行屠宰，且加工過程中工具可能受到耐藥菌的污染，導(dǎo)致整個生產(chǎn)線受到污染，使所有雞源性產(chǎn)品都帶有耐藥菌，而其他地區(qū)的研究是包括活雞及凍雞，活雞含菌量雖然高，但通常單獨屠宰，推測交叉污染的機會比處理好的雞源性產(chǎn)品少。通過PCR的方法對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進(jìn)行基因分型，根據(jù)結(jié)果可知主要基因型為CTX-M型，其檢出率為98.8%，該數(shù)據(jù)與2010年中國雞源性產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌CTX-M型檢出率96.43%[15]、2011年廣東地區(qū)CTX-M型檢出率83.4%[16]的數(shù)據(jù)相似。其他地區(qū)如哈爾濱CTX-M型流行率為71.5%[11]、青島CTX-M型流行率為100%[17]、河南CTX-M型流行率為89.8%[13]，說明澳門地區(qū)和中國內(nèi)地的雞源性產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌主要流行的基因型均為CTX-M型。但澳門地區(qū)的數(shù)據(jù)與遼寧的數(shù)據(jù)不相似，遼寧的雞源性產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的主要流行基因型為TEM型，其檢出率為100%[13]，而澳門地區(qū)TEM型的檢出率為25.0%，這說明了不同地區(qū)的耐藥基因型流行率間存在差異，可能是地域不同或抗生素的使用方法不同。同時本次研究還分別用PstI和PvuII這2種限制性內(nèi)切酶對大腸埃希菌的CTX-M型基因擴增產(chǎn)物進(jìn)行切割，根據(jù)切割結(jié)果可知其主要流行型為 CTX-M-G1型66.3%，其次為CTX-M-G9型31.9%，此數(shù)據(jù)也與山東[18]和深圳[19]CTX-M型大腸埃希菌中主要以CTX-M-G1和CYX-M-G9為主的數(shù)據(jù)相符。

產(chǎn)ESBLs細(xì)菌除了對第3代頭孢菌素耐藥外, 質(zhì)粒上同時攜帶其他耐藥基因, 對氨基糖苷類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類等抗菌藥物交叉耐藥, 本實驗結(jié)果顯示, 84個非重復(fù)株除了碳青霉烯類的亞胺培南和美羅培南均未出現(xiàn)耐藥情況外, 呈現(xiàn)4種以上耐藥占83.3%, 5種以上耐藥占54.7%, 可見多重耐藥的大腸菌株在澳門市售雞源性產(chǎn)品普遍檢出，容易通過食物鏈傳遞給人, 造成公共衛(wèi)生的風(fēng)險。澳門地區(qū)因禽流感的原因而限制活雞的進(jìn)口，故澳門地區(qū)無活雞只有冰鮮雞或急凍雞，追溯這些冰鮮雞和急凍雞的來源可知它們分別來自9個不同食品公司加工廠。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)可知不同雞場的基因流行率存在差異，這可能是因為不同雞場對抗生素的使用方式不同或在對雞源性產(chǎn)品的處理時有污染而導(dǎo)致的。為進(jìn)一步探討本次實驗的數(shù)據(jù)與健康人群腸道中產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的流行率的相關(guān)性，需將兩者數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，進(jìn)而了解兩者間的關(guān)聯(lián)。從而提高人們對耐藥菌株的產(chǎn)生的關(guān)注度，重視耐藥基因型的特征，做到合理使用抗生素，以降低耐藥菌的檢出率。

利益沖突：無