余佳紅， 童玉， 葉開， 陳天琰， 唐彬， 胡嘉波

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

腦卒中的致病機制非常復(fù)雜，其中谷氨酸興奮性毒性是神經(jīng)損傷的重要病理機制[1]。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的一類神經(jīng)興奮性遞質(zhì)[2]，可作為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3]。當腦缺氧缺血造成神經(jīng)細胞損傷后，大量谷氨酸釋放至突觸間隙，引起谷氨酸受體過度激活，使Ca2+不斷內(nèi)流，發(fā)生DNA損傷和細胞凋亡等一系列級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性毒性的發(fā)生[4-5]。谷氨酸生理濃度不會造成神經(jīng)元損傷，但是病理情況發(fā)生時，谷氨酸過度積累會造成神經(jīng)元過度興奮，最終導(dǎo)致其壞死、凋亡[6]。目前治療腦卒中的方法主要通過切斷興奮性毒性的傳遞途徑來改善卒中恢復(fù)[7-8]。微囊泡是由親本細胞分泌的一種活性物質(zhì)，直徑為100～ 1 000 nm的雙層脂質(zhì)囊泡，具有便于凍存、安全、低免疫原性等優(yōu)點[9]。然而，人神經(jīng)干細胞微囊泡(human neural stem cell microvesicles, hNSC-MVs)是否具有神經(jīng)元保護作用尚不清楚。因此，本實驗建立谷氨酸體外損傷模型，研究hNSC-MVs對谷氨酸誘導(dǎo)PC12細胞損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤PC12細胞購于中國科學(xué)院細胞庫；人神經(jīng)干細胞由課題組先前研究獲得[10]；DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司)；非必需氨基酸、B27(加拿大Stemcell Technologies公司)；重組人堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子(美國PeproTech公司)；基質(zhì)膠(美國Corning公司)；谷氨酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；MTT試劑(美國Amresco公司)；0.45 μm PVDF膜(德國Merck Millipore公司)；兔抗大鼠Bax、小鼠抗大鼠Bcl-2和兔抗大鼠β-肌動蛋白一抗、山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗(英國Abcam公司)；BCA試劑盒、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)公司)；蛋白酶抑制劑PMSF(南京福麥斯公司)；牛血清白蛋白(上海源葉公司)；細胞膜紅色熒光探針(Dil，美國Sigma公司)；4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，美國Thermo Fisher公司)。

CO2細胞培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)；超凈工作臺(上海博訊實業(yè)有限公司)；倒置顯微鏡(南京永新光學(xué)有限公司)；超高速低溫離心機(美國Beckman Coulter公司)；酶標儀(美國Bio-Tek公司)；蛋白電泳儀、垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(法國Vilber公司)；FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；納米顆粒跟蹤分析儀(英國NanoSight公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胚胎干細胞源神經(jīng)干細胞由課題組前期研究所得，參考Chen等[10]方法培養(yǎng)。神經(jīng)干細胞生長于基質(zhì)膠，并維持在神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中，即含有1%非必需氨基酸，2% B27、20 μg/L重組人堿性成纖維細胞生長因子和20 μg/L表皮生長因子的DMEM/F12。PC12細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中。

1.2.2 微囊泡的分離及粒徑分析 微囊泡分離程序如先前所述進行[11]。首先收集神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液，于4 ℃以2 000×g離心30 min，以除去細胞碎片或沉淀雜質(zhì)；隨后于4 ℃以100 000×g離心70 min；棄上清液，用PBS洗滌；同樣條件下重復(fù)2次之前超速離心步驟，最后棄上清液，用100 μL PBS重懸沉淀，即hNSC-MVs，-80 ℃儲存?zhèn)溆?。BCA試劑盒檢測hNSC-MVs蛋白濃度。將微囊泡注入儀器樣品室，用納米顆粒跟蹤分析儀分析hNSC-MVs粒徑。每個樣品重復(fù)3次。

1.2.3 PC12細胞內(nèi)化hNSC-MVs 將hNSC-MVs在37℃下用Dil標記15 min；PBS洗滌3次；4 ℃以100 000×g離心2 h；將Dil標記的hNSC-MVs(20 mg/L)加入PC12細胞中，孵育24 h；PBS洗滌3次；用DAPI進行核染色；細胞圖像通過激光掃描共聚焦顯微鏡獲得。

1.2.4 PC12細胞損傷模型的建立及分組

1.2.4.1 谷氨酸濃度的選擇 用含不同濃度的谷氨酸(0、5、10、15、20、25 mmol/L)無血清培養(yǎng)基處理PC12細胞24 h，用MTT分析細胞存活率；其中25 mmol/L谷氨酸處理24 h后細胞存活率降低至50%，選擇該濃度建立谷氨酸興奮性損傷模型進行下一步實驗。

1.2.4.2 實驗分組 實驗分為3組，對照組：DMEM預(yù)處理24 h，棄培養(yǎng)液，加入無血清DMEM；谷氨酸組：DMEM預(yù)處理24 h，棄培養(yǎng)液，加入含25 mmol/L谷氨酸的無血清DMEM刺激24 h；hNSC-MVs+谷氨酸組：含200 mg/L hNSC-MVs的DMEM預(yù)處理24 h，棄培養(yǎng)液，加入含25 mmol/L谷氨酸的無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.5 MTT法檢測PC12細胞存活率 將PC12細胞以1×104/mL密度接種于96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞貼壁后，用PBS洗3遍；按“1.2.4.2”分組處理；每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，孵育4 h；棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜振蕩10 min，使藍紫色結(jié)晶完全溶解；用酶標儀測定490 nm波長處光密度(D)值，并計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組D值-空白組D值)/(對照組D值-空白組D值)×100%。

1.2.6 免疫印跡實驗檢測Bax和Bcl-2蛋白表達 PC12細胞接種于6孔板，按“1.2.4.2”實驗分組處理；棄上清液，用預(yù)冷PBS洗滌3次；加入100 μL含1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用細胞刮刀充分刮取6孔板中的細胞，將細胞裂解液收集于EP管中，置于冰上裂解1 h；期間每15 min漩渦振蕩1次；樣本于4℃以12 000×g離心15 min；取上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。取適量蛋白質(zhì)樣品行SDS-PAGE；70 V電泳30 min后調(diào)至110 V繼續(xù)電泳60 min；350 mA濕轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜；用含5%脫脂奶粉的TBST孵育1 h；加入一抗于4 ℃孵育過夜，β-肌動蛋白抗體(1 ∶ 5 000)、Bax抗體(1 ∶ 1 000)和Bcl-2抗體(1 ∶ 1 000)；TBST洗膜3次，每次15 min；用HRP標記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次15 min；最后對條帶進行曝光顯影。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細胞形態(tài)和微囊泡粒徑分析

倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，神經(jīng)干細胞在基質(zhì)膠生長，細胞大小均一，集落呈典型的玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)。納米微粒跟蹤分析顯示，hNSC-MVs顆粒濃度為7.4×108顆粒/mL，直徑為50～1 000 nm，平均為141.7 nm。見圖1。

圖1 神經(jīng)干細胞和神經(jīng)干細胞微囊泡

2.2 PC12細胞內(nèi)化神經(jīng)干細胞微囊泡

倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，正常PC12細胞呈多邊形貼壁生長，有明顯的胞體，有類似神經(jīng)突觸的細胞突起結(jié)構(gòu)。PC12細胞與Dil標記的hNSC-MVs孵育24 h后，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，PC12細胞胞質(zhì)中能觀察到Dil標記的紅色熒光，表明PC12細胞能內(nèi)化hNSC-MVs。見圖2。

A：PC12細胞形態(tài)(×100)；B：PC12細胞吞噬Dil標記的hNSC-MVs(×600)

2.3 不同濃度谷氨酸對PC12細胞的損傷作用

MTT檢測結(jié)果顯示，與0 mmol/L組相比，PC12細胞存活率隨著谷氨酸濃度增高而降低，呈一定的濃度依賴性。當谷氨酸濃度為25 mmol/L時，PC12細胞存活率為(49.09±6.04)%，顯著低于0 mmol/L組(q= 8.467，P<0.01)。因此，選擇濃度為25 mmol/L的谷氨酸處理進行后續(xù)實驗。見圖3。

a:P<0.05，b: P<0.01，與0 mmol/L組相比

2.4 微囊泡對谷氨酸損傷PC12細胞存活率的影響

MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，谷氨酸組細胞存活率明顯降低(q=22.44,P<0.01)，而hNSC-MVs+谷氨酸組細胞存活率較谷氨酸組明顯升高(q=12.92,P<0.01)，表明hNSC-MVs可明顯改善谷氨酸損傷的PC12細胞活性。見圖4。

圖4 不同組細胞存活率比較

2.5 微囊泡對谷氨酸損傷PC12細胞凋亡的影響

免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，谷氨酸組細胞Bax蛋白表達水平明顯升高(q=8.577，P<0.01)，Bcl-2表達水平顯著降低(q=17.17，P<0.01)；與谷氨酸組相比，hNSC-MVs+谷氨酸組細胞Bax表達水平明顯降低(q=9.985，P<0.01)，Bcl-2表達水平顯著增高(q=8.649，P<0.01)。見圖5。

圖5 不同組細胞Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較

3 討論

PC12細胞是來源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆的細胞株，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上都類似于原代神經(jīng)元細胞，但與原代神經(jīng)元細胞相比，具有易獲取、體外培養(yǎng)簡便等優(yōu)點，因此常用作體外神經(jīng)元細胞損傷模型的細胞株[12]。谷氨酸誘導(dǎo)PC12細胞損傷模型目前已作為腦缺血缺氧損傷體外研究的常用模型[13-14]。據(jù)報道，谷氨酸誘導(dǎo)PC12細胞損傷存在濃度和時間依賴效應(yīng)，10 μmol/L～40 mmol/L以及5 min～24 h均能對PC12細胞造成不同程度的損傷[15]。文獻報道，在體外細胞損傷模型實驗中，細胞的抑制率一般維持在50%左右，這樣不會因細胞存活率太低或細胞抑制率太低而影響后續(xù)實驗[16-17]。本實驗采用不同濃度的谷氨酸作用PC12細胞24 h，隨著谷氨酸濃度增加，PC12細胞抑制作用隨之增強，呈濃度依賴性。當谷氨酸濃度為25 mmol/L，作用細胞24 h時，PC12細胞存活率降低至50%左右，故選用25 mmol/L谷氨酸濃度作用24 h來建立細胞損傷模型。

微囊泡是由細胞產(chǎn)生和分泌的雙層脂質(zhì)囊泡，構(gòu)成細胞間通訊信號分子的主要載體，包括脂質(zhì)，蛋白質(zhì)，DNA，mRNA，miRNA，siRNA以及l(fā)ncRNAs[18]。課題組前期研究結(jié)果表明，hNSC-MVs能促進背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元軸突生長及坐骨神經(jīng)橫斷性損傷修復(fù)[10]，對心肌細胞也具有抑制其凋亡作用[19]，表明hNSC-MVs可能具有強大的保護與修復(fù)作用。本研究結(jié)果顯示，Dil標記的hNSC-MVs能被PC12細胞吞噬，表明微囊泡能進入細胞內(nèi)部從而發(fā)揮功能。此外，與谷氨酸組相比，一定濃度的hNSC-MVs能顯著增強谷氨酸損傷的PC12細胞的細胞活性，表明hNSC-MVs對谷氨酸損傷的PC12細胞表現(xiàn)出明顯的保護作用?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax是目前已知的最重要的一對凋亡調(diào)控蛋白，兩者形成二聚體起到調(diào)控凋亡的作用，比例失調(diào)時則會影響細胞凋亡[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)hNSC-MVs處理可顯著提高Bcl-2蛋白表達，同時降低Bax蛋白表達，表明hNSC-MVs可能通過Bcl-2/Bax信號通路對谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞損傷發(fā)揮保護作用。但是PC12細胞不能完全替代原代培養(yǎng)的神經(jīng)元，需要直接在體外原代神經(jīng)元和動物模型上做驗證，以進一步明確hNSC-MVs的保護作用，具體作用機制有待進一步研究。