王月霞， 張治進(jìn)， 張玉浩， 傅駿， 秦賢舉

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 上海市第八人民醫(yī)院胃腸外科， 上海 200235)

結(jié)直腸癌占腫瘤發(fā)病率10.2%，死亡率僅次于肺癌，占全球癌癥相關(guān)死亡9.2%[1]?；熓墙Y(jié)直腸癌輔助治療的重要策略之一。天然產(chǎn)物因具有生物友好性和較好的治療效果，在腫瘤化療藥物研發(fā)領(lǐng)域得到越來越多關(guān)注[2-3]。粉防己堿是一種可用于腫瘤化療的天然生物堿，其作為傳統(tǒng)中藥在治療矽肺、關(guān)節(jié)炎和高血壓等疾病中發(fā)揮重要作用[4-7]。近來，關(guān)于粉防己堿的抗腫瘤作用得到廣泛研究，其主要通過靶向多條信號通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，如通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線粒體途徑及胞外死亡受體途徑誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡[8]；通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡[9]；通過介導(dǎo)caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑抑制口腔癌細(xì)胞增殖[10]等；但關(guān)于粉防己堿對腫瘤細(xì)胞遷移的影響還不清楚。HCT116是一種以侵襲遷移為特征的人結(jié)直腸癌低分化細(xì)胞株，具有干細(xì)胞特性[11]。本研究旨在探討粉防己堿對高惡性人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞株生物功能的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所)；DMEM、胎牛血清、青霉素、鏈霉素和胰酶(美國Gibco公司)；粉防己堿(美國Selleck公司)；CCK-8試劑(日本Dojindo公司)；Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑(美國BD公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)和Hoechst 33342細(xì)胞核染色液(上海碧云天生物公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；SDS-PAGE凝膠試劑盒(上海生工生物公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；兔單克隆抗體E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(PKB/AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、核因子激活的B細(xì)胞κ 輕鏈增強蛋白(NF-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)均為美國CST公司產(chǎn)品；兔單克隆抗體GAPDH(英國Abcam公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(美國Jackson公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HCT116細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的DMEM中，于37 ℃，5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8檢測細(xì)胞活力 將對數(shù)期細(xì)胞以7×103/孔密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h；以二甲基亞砜為對照，分別加入100 μL不同濃度的粉防己堿(2.5、5、10、20、40和80 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h；每孔加入10 μL CCK-8試劑，每組設(shè)置5個復(fù)孔，37 ℃孵育2 h；酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度，計算細(xì)胞存活率及粉防己堿半數(shù)抑制濃度(semi inhibition concentration，IC50)。后續(xù)實驗均將對數(shù)期HCT116細(xì)胞接種于6孔板，孵育過夜；次日，以二甲基亞砜為對照，小于IC50粉防己堿(2.5、5、10 μmol/L)處理細(xì)胞后，對應(yīng)實驗檢測粉防己堿對細(xì)胞生物功能的影響。

1.2.3 克隆形成實驗測定細(xì)胞增殖能力 粉防己堿處理細(xì)胞48 h；胰酶消化，PBS清洗后收集細(xì)胞，以300個/孔密度接種于6孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)14 d，在此期間，每3 d更換一次新鮮培養(yǎng)基；待克隆細(xì)胞長至合適大小時終止培養(yǎng)， 4%低聚甲醛固定細(xì)胞30 min；0.1%結(jié)晶紫染色20 min；拍照后Image J軟件計數(shù)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞分布周期和凋亡 粉防己堿處理細(xì)胞24 h；胰酶(不含EDTA)消化，PBS清洗后收集細(xì)胞；取部分細(xì)胞用70%乙醇4 ℃固定2 h；25 μL碘化丙錠常溫避光孵育30 min；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布；同時，根據(jù)Annexin V凋亡檢測試劑盒說明書，用300 μL 1×結(jié)合緩沖液重新懸浮剩余細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，避光孵育15 min；加入5 μL碘化丙錠避光孵育5 min；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；每組設(shè)置3個復(fù)孔，每次至少計數(shù)10 000個細(xì)胞。

1.2.5 熒光染色檢測細(xì)胞早期凋亡 粉防己堿處理細(xì)胞24 h；PBS洗滌；分別加入1 mL 線粒體膜電位檢測試劑JC-1 和Hoechst 33342染色工作液，每組設(shè)置3個復(fù)孔，37 ℃孵育20 min；PBS洗滌后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

1.2.6 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移能力 粉防己堿處理細(xì)胞24 h；胰酶消化，PBS清洗后無血清培基重懸細(xì)胞，分別以3×104/孔密度接種至Transwell小室，下室加600 μL含5%胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)22 h，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗，顯微鏡觀察拍照，Image J軟件計數(shù)。

1.2.7 劃痕實驗測定細(xì)胞遷移能力 粉防己堿處理細(xì)胞24 h；PBS清洗后槍頭垂直劃痕，控制劃痕寬度在300～500 μm之間，PBS清洗劃落細(xì)胞，更換無血清培基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在劃痕后0、48和72 h觀察拍照，Image J軟件計算遷移面積。

1.2.8 蛋白印跡實驗分析蛋白表達(dá)水平 粉防己堿處理細(xì)胞48 h；收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取蛋白，BCA測定蛋白濃度；蛋白煮沸變性；配制10% 分離膠及濃縮膠；加樣后，以70 V恒壓，再以120 V恒壓行SDS-PAGE分離蛋白；恒流350 mA，4 ℃ 2 h半干電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；4℃孵育抗體過夜(實驗用一抗稀釋濃度均為1 ∶ 1 000)；TBST洗滌后常溫孵育二抗1 h(HRP羊抗兔1 ∶ 1 000)；TBST洗滌后ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光，每組實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 粉防己堿降低HCT116細(xì)胞活力

CCK-8實驗結(jié)果顯示，細(xì)胞存活率隨粉防己堿處理濃度的增加而降低, 粉防己堿對HCT116細(xì)胞抑制效應(yīng)呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。見圖1。其在HCT116細(xì)胞24 h的IC50為9.441 μmol/L，故后續(xù)實驗以二甲基亞砜為對照，分別檢測2.5、5、10 μmol/L粉防己堿對細(xì)胞生物功能的影響。

*：P<0.05，與0 μmol/L組比較

2.2 粉防己堿抑制HCT116細(xì)胞增殖

細(xì)胞集落形成實驗結(jié)果顯示，細(xì)胞集落數(shù)隨粉防己堿處理濃度增加而減少，與0 μmol/L組相比，2.5、5和10 μmol/L粉防己堿處理組形成集落數(shù)明顯減少(t=9.134，13.51，16.64，P均<0.05)。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，5 μmol/L和10 μmol/L 粉防己堿處理組G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(t=10.06，21.49，P均<0.05)，而S期(t=7.212，21.54，P均<0.05)和G2/M期(t=12.39，25.26，P均<0.05)細(xì)胞比例明顯下降。見圖2。

2.3 粉防己堿誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，5和10 μmol/L粉防己堿處理組細(xì)胞凋亡比率增加(t=2.969，23.96，P均<0.05)。見圖3。熒光染色檢測細(xì)胞早期凋亡結(jié)果顯示，線粒體膜電位熒光強度隨粉防己堿處理濃度增加而增強。Hoechst 33342細(xì)胞核染色結(jié)果顯示，粉防己堿處理組細(xì)胞核熒光增強，標(biāo)志著粉防己堿處理組細(xì)胞早期凋亡增多。見圖4。

2.4 粉防己堿抑制HCT116細(xì)胞遷移

遷移實驗結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，2.5、5、10 μmol/L粉防己堿處理組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(t=9.057，18.69，19.35，P均<0.05)。見圖5。劃痕實驗結(jié)果顯示，粉防己堿對HCT116細(xì)胞遷移抑制呈現(xiàn)劑量-時間-效應(yīng)關(guān)系，與0 μmol/L組相比，5和10 μmol/L粉防己堿處理組細(xì)胞48 h劃痕修復(fù)率明顯降低(t=4.187，5.260，P均<0.05)，2.5、5、10 μmol/L粉防己堿處理細(xì)胞72 h劃痕修復(fù)率降低(t=5.182，6.376，8.329，P均<0.05)。見圖5。

2.5 粉防己堿可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路逆轉(zhuǎn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

顯微鏡下觀察顯示，與0 μmol/L組相比，經(jīng)10 μmol/L粉防己堿處理的HCT116細(xì)胞多呈圓形，有更多上皮細(xì)胞形態(tài)，而未經(jīng)加藥處理的細(xì)胞多呈梭形間充質(zhì)形態(tài)。見圖6。蛋白印跡結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，2.5、5和10 μmol/L粉防己堿處理組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)標(biāo)志蛋白表達(dá)水平改變：上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)明顯增加(P均<0.05)，而間充質(zhì)標(biāo)志蛋白N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)明顯減少(P均<0.05)。見圖7。進(jìn)一步檢測PI3K/AKT/NF-κB通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，2.5、5、10 μmol/L粉防己堿處理組細(xì)胞通路中關(guān)鍵分子p-AKT(t=22.89，34.88，23.58，P均<0.05)和p-NF-κB(t=24.30，26.12，28.89，P均<0.05)表達(dá)水平均明顯降低，表明其活化受到抑制。見圖8。

*：P<0.05，與0 μmol/L組比較A：細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果；B：流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期實驗結(jié)果

*：P<0.05，與0 μmol/L組比較

A：線粒體膜電位檢測結(jié)果(100×，50 μm)；B：Hoechst 33342細(xì)胞核染色結(jié)果(100×,50 μm)

A：遷移實驗結(jié)果(100×)；B：劃痕實驗結(jié)果(100×)；*：P<0.05，與0 μmol/L組比較

圖6 粉防己堿對HCT116細(xì)胞形態(tài)的影響(100×)

3 討論

既往研究表明，粉防己堿可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡來發(fā)揮抗癌活性，如其通過Bcl-2/Caspase3/PARP途徑使結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞株阻滯于G1/S期，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]；也有研究發(fā)現(xiàn)其通過上調(diào)TGF-β1來抑制PTEN磷酸化，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[13]。本研究結(jié)果顯示，粉防己堿能抑制人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖，使細(xì)胞停滯于G0/G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞不受抑制的增殖常伴有細(xì)胞周期失調(diào)[14]。由此說明粉防己堿可能通過阻滯細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但粉防己堿是否影響結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞株其他生物學(xué)行為，如遷移、EMT、腫瘤相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活等還需要進(jìn)一步研究。

*：P<0.05，與0 μmol/L組比較

*：P<0.05，與0 μmol/L組比較

細(xì)胞遷移是惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要步驟，抑制腫瘤細(xì)胞遷移是防止惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的前提和基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，小于IC50的粉防己堿能顯著抑制HCT116細(xì)胞遷移。多項研究證實，EMT與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、抗凋亡等多項惡性表型相關(guān)[15]。EMT是指上皮細(xì)胞在一些因素作用下，失去細(xì)胞極性，丟失細(xì)胞間緊密連接和黏附連接，轉(zhuǎn)變成具有間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的細(xì)胞；不適當(dāng)?shù)腅MT參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移，使腫瘤細(xì)胞逃逸某些因素誘導(dǎo)的凋亡,獲得腫瘤干細(xì)胞樣特性[15-16]。HCT116細(xì)胞多呈梭形間充質(zhì)形態(tài)，以侵襲遷移為特征，有著EMT標(biāo)志性變化[11]。本研究結(jié)果顯示，小于IC50的粉防己堿能上調(diào)HCT116細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)，同時下調(diào)間充質(zhì)性標(biāo)志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)。由此提示，粉防己堿可能通過逆轉(zhuǎn)HCT116細(xì)胞EMT，進(jìn)而降低細(xì)胞遷移能力。

研究表明，PI3K/AKT信號通路廣泛參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞多項生物學(xué)行為，在促進(jìn)和維持腫瘤惡性表型方面起關(guān)鍵作用[17]。為進(jìn)一步探究粉防己堿影響HCT116細(xì)胞生物功能的分子機制，本實驗利用蛋白印跡技術(shù)檢測小于IC50的粉防己堿對細(xì)胞PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵分子表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示，該通路中關(guān)鍵分子p-AKT活化明顯受到抑制。研究證實，NF-κB是活化的AKT重要的下游靶點之一，參與調(diào)控多種生物進(jìn)程，如姜黃素通過抑制NF-κB信號逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞EMT,抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[18]；烏苯美司通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路的激活，抑制胃癌細(xì)胞增殖[19]。本研究結(jié)果顯示，粉防己堿能下調(diào)HCT116細(xì)胞中p-NF-κB表達(dá)水平，由此推測粉防己堿可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型，但其影響腫瘤細(xì)胞生物功能的具體分子靶點仍需進(jìn)一步探索。

綜上，本實驗證明粉防己堿可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB 信號途徑，逆轉(zhuǎn)HCT116細(xì)胞EMT，進(jìn)而降低細(xì)胞增殖遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。