張雅丹,趙夢倩,楊煜佼,徐友志,王梓郡,王焱君,許迪雅,張 琳,*,周彬彬,2,*

(1.特醫(yī)食品加工湖南省重點實驗室,稻谷及副產物深加工國家工程實驗室,中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院,湖南 長沙 410004;2.湖南省食品質量監(jiān)督檢驗研究院,湖南 長沙 410117)

阿爾茲海默癥,俗稱老年癡呆,是一種神經退行性疾病。隨著我國人口老齡化問題的加劇,老年癡呆患者的人數也在不斷增加,2050年我國老年癡呆病患者將會達到2 700萬甚至更多[1]。目前對于老年癡呆發(fā)病機制的認識主要集中于β淀粉樣蛋白的沉積[2]、tau蛋白的過度磷酸化[3]以及氧化應激損傷[4]等。以Cu2+作為催化劑,催化H2O2反應產生羥自由基進而引起神經細胞的氧化應激,使神經細胞出現損傷甚至發(fā)生凋亡,這是導致阿爾茲海默癥的一個重要假說機制[5-6]。

鐵皮石斛是我國一種傳統的名貴中藥,可以清熱滋陰,生津益胃,有著豐富的藥用價值[7]。鐵皮石斛中含有大量的活性成分,如石斛堿、石斛糖類、芪類及其衍生物、多糖、氨基酸、微量元素以及多種揮發(fā)性物質[8]等。醫(yī)學研究表明,鐵皮石斛具有抗衰老、抗腫瘤[9]、降低血糖[10]、提高免疫功能[11-12]等作用,對惡性腫瘤、胃腸道疾病、糖尿病、白內障、關節(jié)炎、血栓閉塞性脈管炎及慢性咽炎等疾病具有很好的療效。

目前鐵皮石斛多糖的提取方法主要是水提醇沉法[13]、超聲法[14]、酶提法[15]、超高壓提取法[16]、超微粉碎法[17]、閃式提取法[18]等。己有研究發(fā)現鐵皮石斛多糖具有一定的抗氧化特性,可以清除超氧陰離子自由基并且可以顯著提高小鼠肝組織及血清中谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶活力,降低丙二醛含量[19]。除此之外,鐵皮石斛多糖還具有清除氧自由基和抗脂質過氧化的能力[20],在增強免疫力[21]、抑制腫瘤[22]、抗癌[23]和抗衰老[24]方面有著廣泛的用途。但是鐵皮石斛多糖對羥自由基誘導的神經細胞凋亡的抑制作用鮮見報道。本研究通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化鐵皮石斛多糖的提取工藝,并利用優(yōu)化工藝后的鐵皮石斛多糖提取物針對其抗氧化作用和對羥自由基誘導的SH-SY5Y細胞凋亡進行研究,探討鐵皮石斛多糖提取物對于神經細胞的保護作用,以期為老年癡呆癥的治療提供新的方向并為鐵皮石斛多糖的相關產品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛 深圳市源匯升生物科技有限公司;纖維素酶(酶活力1 000 U/g)、果膠酶(酶活力10 000 U/g)、中性蛋白酶(酶活力50 000 U/g) 上?；鈱崢I(yè)有限公司;果糖、甘露糖、葡萄糖(均為食品級) 上海源葉生物科技有限公司;三氟乙酸(分析純) 上海麥克林生化科技有限公司;乙腈(分析純) 瑞典Oceanpak公司;CuSO4·5H2O、H2O2(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;抗壞血酸(分析純) 北京鼎國昌盛生物技術有限公司;SH-SY5Y細胞 中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心;噻唑藍(methyl thiazoly1 tetrazolium,MTT)、香豆素-3-羧酸(coumarin-3-carboxylic acid,CCA) 美國Sigma公司;DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶(含EDTA) 美國Gibico公司;流式凋亡檢測試劑盒 美國Promege公司。

1.2 儀器與設備

DK-522電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;SB-5200超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;YRE-5299旋轉蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責任公司;722S紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;DNM-9602酶標儀 北京普朗新技術有限公司;F-4600熒光分光光度計 日本Hitachi公司;S111 CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Electron公司;AV52428流式細胞儀 美國Beckman公司;LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮石斛多糖提取工藝的優(yōu)化

1.3.1.1 鐵皮石斛多糖的提取

準確稱取鐵皮石斛粉末0.5 g,用蒸餾水將其溶解,用0.1 mol/L NaOH溶液調pH值為5.4,再加入一定濃度的復合酶(纖維素酶和果膠酶1∶1等質量混合),40 ℃水浴2 h后,90 ℃滅酶10 min,冷卻至室溫。將所得物進行一定時間的超聲提取,4 000 r/min離心15 min,取上清液置于旋轉蒸發(fā)儀中進行濃縮。所得濃縮液再加入4 倍體積的95%乙醇溶液沉淀8 h,4 000 r/min離心15 min,沉淀物即為鐵皮石斛粗多糖。用30 mL蒸餾水溶解粗多糖,用0.1 mol/L NaOH溶液調pH值為7.0,再加入0.9 g中性蛋白酶,50 ℃水浴酶解4 h,加入氯仿-正丁醇(4∶1,V/V)的混合試劑6 mL,磁力攪拌1 h。4 000 r/min離心15 min,提取物分為3 層,去掉中間層的變形蛋白后,重復操作,直至無變形蛋白析出。將所得液體置于分液漏斗中靜置。溶液分為2 層,去除下層有機溶劑,上層即為多糖溶液[25-26]。將多糖溶液經冷凍干燥后粉碎成粉末。

1.3.1.2 鐵皮石斛多糖得率測定

采用苯酚-硫酸法[27]測定多糖,準確稱取葡萄糖標準品20 mg,加入蒸餾水定容至500 mL,分別移取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL標準液于試管中,加蒸餾水至2 mL。加入6%苯酚1 mL和濃硫酸5 mL,室溫放置20 min后于波長490 nm處測其吸光度,繪制標準曲線Y=0.087 9X－0.032 09(R2=0.997 8),Y為吸光度,X為多糖含量。按式(1)計算鐵皮石斛多糖得率:

1.3.1.3 單因素試驗

料液比的確定:在超聲時間1 h、復合酶(纖維素酶和果膠酶1∶1等質量混合)質量分數10%條件下,分別測定料液比為1∶30、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200(g/mL)時多糖得率;超聲時間的確定:在料液比1∶100(g/mL)、復合酶質量分數40%條件下,分別測定超聲時間為1、1.5、2、2.5、3 h時多糖得率;復合酶質量分數的確定:在料液比1∶100(g/mL)、超聲時間1.5 h條件下,分別測定復合酶質量分數10%、20%、30%、40%、50%時多糖得率。

1.3.1.4 正交試驗設計

根據單因素試驗結果,采用L9(34)正交表設計3因素3水平正交試驗,對鐵皮石斛多糖提取工藝進行優(yōu)化[28-29],各因素及水平設計如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and their levels used in orthogonal array design

1.3.2 鐵皮石斛多糖的組成成分分析

準確稱取5 mg果糖、甘露糖、葡糖糖溶于5 mL超純水中得到單糖母液。

準確稱取冷凍干燥后的粉末50 mg,溶解于10 mL超純水中。分別吸取5 mL多糖溶液于2 個玻璃瓶中,其中一瓶不進行水解,另外一瓶加入4 mol/L三氟乙酸溶液5 mL,120 ℃油浴水解2 h。用6 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH值至中性,未水解與水解過的多糖溶液均過0.45 μm濾膜,備用。

高效液相色譜檢測條件:氨基柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫35 ℃;流動相:超純水-乙腈(75∶25,V/V);流速1 mL/min;進樣量20 μL。蒸發(fā)光散射器條件:氮氣流速2.4 L/min,漂移管溫度95 ℃。

1.3.3 CCA熒光標記法測定羥自由基清除率

向終濃度為6 μmol/L Cu2+和40 μmol/L H2O2的溶液中加入100 μmol/L pH 7.4的CCA溶液以及pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液制成150 μL的測定液,外覆錫箔紙避光。設置激發(fā)波長390 nm,將上述測定液加入到微量比色皿中,測定其在波長450 nm處的熒光強度。在以上混合液中再加入10 mmol/L抗壞血酸或不同質量濃度的鐵皮石斛多糖提取物,重復測定操作。

1.3.4 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)

將SH-SY5Y細胞接種于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞長到培養(yǎng)皿的80%～90%時對其進行傳代,根據細胞的生長速率定時對其進行換液。

1.3.5 MTT法測定細胞存活率

SH-SY5Y細胞培養(yǎng)至可傳代狀態(tài),經胰酶消化后,取適量細胞液于血球計數板上,細胞計數后,將每孔接種了2×105個細胞的96 孔板置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h使其貼壁生長。吸除上述96 孔板中的培養(yǎng)基,配制一定質量濃度梯度的鐵皮石斛多糖提取物(20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL),分別加入到96 孔板中各100 μL,同時設置空白組和對照組于同一板上,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁生長。吸除上述96 孔板中的藥液,配制含10% MTT的培養(yǎng)基,加入到板中各孔100 μL,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸除上述96 孔板中的藥液,各孔加入100 μL的二甲基亞砜試劑,用酶標儀在波長492 nm處測定吸光度并記錄數值,計算得出細胞存活率,得到無毒性損傷的最大質量濃度值。再將6 μmol/L Cu2+和40 μmol/L H2O2連同10 mmol/L抗壞血酸或無損傷質量濃度的鐵皮石斛多糖提取物一同加入到細胞中,重復MTT比色法實驗,根據式(2)計算細胞存活率。

式中:A0為空白組吸光度;A1為對照組吸光度;A2為實驗組吸光度。

1.3.6 流式細胞儀測定細胞凋亡

將SH-SY5Y細胞培養(yǎng)至可傳代狀態(tài),經胰酶消化后吹打成單個細胞,向6 孔板中每孔加入0.5 mL細胞液,再加入1 mL培養(yǎng)基,置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h使其貼壁生長。將上述6 孔板中的培養(yǎng)基吸掉,分別加入80 μg/mL鐵皮石斛多糖、6 μmol/L Cu2+、40 μmol/L H2O2、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2+、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2++20 μg/mL鐵皮石斛多糖、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2++40 μgm/L鐵皮石斛多糖、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2++60 μg/mL鐵皮石斛多糖、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2++80 μg/mL鐵皮石斛多糖溶液各1 mL,同時設置空白對照組,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。將6 孔板中不同處理組的SH-SY5Y細胞溶液收集到15 mL離心管中,收集好的細胞1 000 r/min離心5 min,棄上清液,每管中加入1 mL的1×結合液重懸細胞,再加入4 μL異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和4 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI),通過流式細胞儀測定細胞的凋亡率。

1.4 統計學分析

使用SPSS 17.0對實驗結果進行數據分析,兩組間均數比較用t檢驗進行,組間均數比較用單因素方差分析進行,P＜0.05及P＜0.01均為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛提取條件的單因素試驗結果

2.1.1 料液比對鐵皮石斛多糖得率的影響

圖1 料液比對鐵皮石斛多糖得率的影響Fig. 1 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction yield of D. officinale polysaccharides

如圖1所示,料液比在1∶30～1∶100時,多糖得率隨提取液使用量的增加而上升,這是由于當料液比大于1∶100時,蒸餾水過少導致鐵皮石斛多糖不能完全從物料中溶出,因此多糖得率會隨著蒸餾水的增多而增加;料液比在1∶100～1∶200時,多糖得率隨著提取液使用量上升而出現下降趨勢,這是由于溶劑的增加導致其對超聲波能量吸收增多,而鐵皮石斛粉末對于超聲波能量的吸收減少[30],使細胞壁不能完全破碎,多糖的溶出被抑制[31]。因此,選取1∶50、1∶100、1∶150(g/mL)作為正交試驗的3 個水平。

2.1.2 復合酶質量分數對鐵皮石斛多糖得率的影響

由圖2可知,在復合酶質量分數為10%～50%(酶質量占鐵皮石斛物料質量的百分數)的范圍內,隨著復合酶質量分數的增大,鐵皮石斛多糖得率上升,當其質量分數達到40%以后,得率增長趨勢變緩。這是因為在復合酶量小于40%時,隨著酶質量分數的增加,酶對鐵皮石斛細胞壁的破壞程度加強,因此加快活性成分溶出細胞的速率,提高得率;但當酶質量分數大于40%時,大部分細胞壁己經被破壞,再加大酶量對得率的影響減小。綜合得率和成本,選取30%、40%、50%作為正交試驗的3 個水平。

圖2 復合酶質量分數對鐵皮石斛多糖得率的影響Fig. 2 Effect of enzyme concentration on extraction yield of D. officinale polysaccharides

2.1.3 超聲時間對鐵皮石斛多糖得率的影響

圖3 超聲時間對鐵皮石斛多糖得率的影響Fig. 3 Effect of ultrasonication time on extraction yield of D. officinale polysaccharides

由圖3可知,在1～3 h內,隨著超聲時間的延長,鐵皮石斛多糖得率呈上升趨勢。當超聲時間小于1.5 h時,多糖得率的升高較為明顯,但當超聲時間大于1.5 h時,多糖得率沒有明顯增加,這是由于因分子運動引起的溶質溶出己經接近平衡[32],再延長超聲時間并不會對得率有顯著作用。綜合考慮得率和節(jié)能省時的因素,選取1、1.5、2 h作為正交試驗的3 個水平。

2.2 正交試驗結果

表2 L9（34）正交試驗設計及結果Table 2 L9(34) orthogonal array design with experimental results

由表2可知,各因素對于多糖得率的影響程度為復合酶質量分數＞料液比＞超聲時間。酶解超聲法提取鐵皮石斛總糖的最佳工藝組合為A2B3C3。經驗證實驗,最佳工藝組合為A2B3C3平均得率為25.69%,因此,確定最佳提取條件為料液比1∶100(g/mL)、復合酶質量分數50%、超聲時間2 h。

2.3 鐵皮石斛多糖的單糖組成

圖4 單糖標準品（A）和水解后鐵皮石斛多糖提取物（B）色譜圖Fig. 4 HPLC chromatograms of mixed monosaccharide standards (A) and monosaccharides derived from D. officinale polysaccharides (B)

為確定鐵皮石斛多糖提取物中單糖的組成成分,以果糖、甘露糖和葡萄糖作為標準品,采用高效液相色譜法[33]對鐵皮石斛多糖組分進行測定。如圖4A所示,混合標樣中3 種單糖的流出順序及保留時間分別為果糖7.678 min、甘露糖8.795 min、葡萄糖9.730 min。未水解的鐵皮石斛多糖樣品進樣后,僅在2.5 min左右有一個大的色譜峰,其他位置并未有色譜峰出現。這是因為非單糖組分在糖柱中會快速被沖洗出來,在柱中并不會有保留,因此在本實驗條件下,在未水解的鐵皮石斛多糖樣品中并未有單糖被檢出(因其色譜峰在標樣位置并沒有峰,因此未附圖)。經水解后的鐵皮石斛多糖中有2 種單糖被檢出,如圖4B所示,保留時間分別為8.754 min和9.687 min,因此推斷鐵皮石斛多糖中主要的單糖組成分別為甘露糖和葡萄糖。

2.4 鐵皮石斛多糖提取物對Cu2+催化H2O2產生羥自由基清除作用

在老年癡呆病人腦中,有過量沉積的Cu2+,其濃度高達0.4 mmol/L[34],而細胞代謝和體內氧化還原反應會產生一定量的H2O2[35],Cu2+可催化H2O2生成羥自由基,進而誘導氧化應激效應,導致神經細胞凋亡[36-37]。因此研究鐵皮石斛多糖對Cu2+催化H2O2產生的羥自由基的清除效果對于研究其對神經細胞的保護作用有重要意義。如圖5所示,抗壞血酸具有一定的清除Cu2+催化H2O2產生的羥自由基的能力,但是對比鐵皮石斛多糖,10 mmol/L抗壞血酸羥自由基清除率為43.02%,而20 μg/L的鐵皮石斛多糖,羥自由基清除率達71.73%,當繼續(xù)增加鐵皮石斛的質量濃度時,羥自由基清除率并沒有顯著變化。因此,鐵皮石斛多糖具有清除羥自由基的能力,且其能力大于抗壞血酸。

圖5 抗壞血酸和鐵皮石斛多糖提取物對H2O2/Cu2＋產生的羥自由基的清除作用Fig. 5 Hydroxyl radical scavenging capacity of ascorbic acid and D. of ficinale polysaccharides

2.5 鐵皮石斛多糖提取物對SH-SY5Y細胞的保護作用

2.5.1 對SH-SY5Y細胞存活率的影響

圖6 鐵皮石斛多糖提取物對SH-SY5Y細胞存活率的影響Fig. 6 Effect of Dendrobium of ficinale polysaccharides on the viability of SH-SY5Y cells

如圖6所示,當鐵皮石斛多糖質量濃度小于80 μg/mL時,基本對細胞存活率無顯著影響(P＞0.05);而當鐵皮石斛多糖質量濃度大于80 μg/mL時,細胞存活率會極顯著降低(P＜0.01)。證明高質量濃度(大于80 μg/mL)的鐵皮石斛多糖具有一定的神經細胞毒性。這可能是因為過高的多糖濃度會引起細胞滲透壓的改變,從而引起細胞毒性[38]。

2.5.2 對Cu2+催化H2O2產生羥自由基造成的SH-SY5Y細胞存活率下降的抑制作用

圖7 H2O2、Cu2＋、抗壞血酸和鐵皮石斛多糖提取物對細胞存活率的影響Fig. 7 Effects of H2O2, Cu2＋, ascorbic acid and D. of ficinale polysaccharides,alone and in combination, on the viability of SH-SY5Y cells

如圖7所示,單獨Cu2+溶液的細胞存活率可達93.33%,單獨H2O2的細胞存活率為57.67%,H2O2/Cu2+混合溶液細胞存活率下降到43.63%,這是因為Cu2+催化H2O2產生的羥自由基具有比H2O2更強的神經細胞毒性[39]。當加入10 mmol/L抗壞血酸時,細胞存活率上升至55.53%,而隨著不同質量濃度鐵皮石斛多糖的加入,細胞存活率從60.20%上升到83.82%。證明鐵皮石斛多糖具有抑制由H2O2/Cu2+產生的羥自由基誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的能力,且其能力遠大于抗壞血酸。

2.5.3 對Cu2+催化H2O2產生的羥自由基誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的抑制作用

圖8 鐵皮石斛多糖粗提物抑制HO/Cu2＋誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的22流式圖（A）和凋亡率圖（B）Fig. 8 Flow cytometric patterns (A) and apoptosis rates (B) of SH-SY5Y cells in the presence of different concentrations of D. of ficinale polysaccharides, 40 μmol/L H2O2 and 6 μmol/L Cu2＋separately and in combination

利用流式細胞法研究鐵皮石斛多糖對羥自由基誘導的神經細胞凋亡的抑制作用,結果如圖8所示,細胞凋亡分為早凋和晚凋,即a2+a4為細胞凋亡率。對照組細胞的凋亡率為15.62%,單獨H2O2處理的細胞的凋亡率為55.20%,單獨Cu2+處理的細胞的凋亡率為22.26%,H2O2/Cu2+混合溶液中細胞凋亡率為56.97%。隨著鐵皮石斛多糖的加入,在20～80 μg/mL范圍內,細胞的凋亡率隨鐵皮石斛多糖提取物質量濃度增大而減小,由56.97%降至17.97%。證明鐵皮石斛多糖能夠有效抑制Cu2+催化H2O2產生的羥自由基誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。

3 結 論

采用酶解超聲提取法提取鐵皮石斛多糖,通過單因素試驗和正交試驗確定最佳的提取條件為料液比1∶100(g/mL)、超聲時間2 h、復合酶質量分數50%,此時多糖得率為25.69%。通過高效液相色譜法測得鐵皮石斛多糖中含有甘露糖和葡萄糖2 種單糖。通過羥自由基清除實驗和MTT細胞存活率及細胞流式實驗,證明鐵皮石斛多糖可以通過清除Cu2+催化H2O2產生的羥自由基,從而有效抑制SH-SY5Y細胞的凋亡。