張蒙娜,宋恭帥,王海星,饒 偉,王宏海,*,沈 清,5,*

(1.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室,浙江工商大學海洋食品研究院,浙江 杭州 310012;2.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇 南京 210095;3.浙江省麻醉重點實驗室,溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院,浙江 溫州 325000;4.沃特世科技(上海)有限公司,上海 201206;5.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,大連工業(yè)大學,遼寧 大連 116034)

帶魚(Trichiurus japonicus)廣泛分布于大西洋、西太平洋、印度洋以及我國渤海至南海海域,是一種重要的海洋經(jīng)濟魚類[1]。帶魚魚肉富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素以及多種礦物質(zhì),為高脂魚類,其中二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)的含量明顯高于淡水魚類,具有較高的營養(yǎng)價值。且?guī)~肉質(zhì)綿軟細膩,味道鮮美,魚身無細刺,同樣也適用于小孩和老人食用,因此深受廣大消費者歡迎[2]。在我國,油炸是帶魚的一種常用烹飪方式,油炸帶魚口感香脆不茹連,魚肉外焦里嫩,常出現(xiàn)在中國老百姓的餐桌上。但是傳統(tǒng)油炸方式使帶魚中植物油含量高,不利于心血管健康。

空氣油炸作為一種新型油炸技術(shù),將樣品置于熱空氣中而不是浸泡在油中,只需極少量由空氣循環(huán)帶起來的小油滴與樣品直接接觸,從而實現(xiàn)快速加熱和脆化,就能獲得與傳統(tǒng)油炸方式類似的外觀、質(zhì)地、風味和口感[3-5]。此技術(shù)相較于傳統(tǒng)方式更方便安全且降低了接近80%的含油量,大幅度減少了油炸食品中的熱量,在一定程度上有助于解決油炸食品引起的肥胖問題[6]。溫度是空氣油炸技術(shù)的一個重要參數(shù),溫度的高低對食品的品質(zhì),尤其是食品的營養(yǎng)成分有較大的影響,因此對于不同油炸溫度條件下的樣品組成成分進行實時監(jiān)測尤為重要。

快速蒸發(fā)離子化質(zhì)譜(rapid evaporative ionization mass spectrometry,REIMS)是一種新興技術(shù),使用iKnife裝置切入樣品組織中,形成氣溶膠,再由運輸管道進入質(zhì)譜儀的電離源,在激烈的碰撞表面發(fā)生離子化過程[7]。該技術(shù)無需任何樣品處理,僅需幾秒就能完成數(shù)據(jù)采集和分析,規(guī)避了傳統(tǒng)質(zhì)譜技術(shù)用時較長的問題,能對樣品進行高通量實時監(jiān)測[8]。在國外,REIMS技術(shù)主要用于醫(yī)療干預期間組織的鑒定,但最近發(fā)現(xiàn)其可應用于食品分析鑒別方面[9-11]。Verplanken等[12]采用REIMS對公豬膻味進行鑒別分析,發(fā)現(xiàn)其在母豬、有膻味公豬和無膻味公豬之間具有極強的鑒別能力,從而實現(xiàn)在公豬屠宰期間對胴體的實時鑒定。Song Gongshuai等[13]利用REIMS技術(shù)能明顯地實時區(qū)分三文魚和虹鱒魚,為確保三文魚產(chǎn)品的真實性提供了前線的檢測方式。由此可見,REIMS在國內(nèi)食品領(lǐng)域?qū)⒕哂锌捎^的應用前景。

本研究首先將iKnife的切割輸出功率進行優(yōu)化,然后采用空氣油炸方法對帶魚進行處理,基于REIMS技術(shù),對不同油炸溫度條件下的帶魚樣品進行實時鑒別分析,探究油炸溫度對于帶魚脂肪酸和磷脂組成成分的影響。REIMS在國內(nèi)鮮有報道,本實驗旨在介紹一種新型的質(zhì)譜技術(shù),將其應用于食品領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

帶魚 市購;甲醇、乙腈、丙二醇(均為色譜純)美國Merck公司;亮氨酸腦啡肽 美國Sigma公司;超純水由Millipore超純水儀制備。

1.2 儀器與設(shè)備

REIMS系統(tǒng)、Xevo G2-XS四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(配有快速蒸發(fā)離子源)、REIMS質(zhì)譜進樣接口 美國Waters公司;WSD151 iKnife智能刀 德國Weller公司;Pump11 elite針泵注射進樣器 美國Harvard公司;Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng) 美國Millipore公司;KL-J63A空氣炸鍋 杭州九陽公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將帶魚進行內(nèi)臟清理,并洗凈切斷備用。置于空氣油炸鍋中,分別于160、170、180 ℃油炸10 min,經(jīng)自然冷卻后進行檢測。

1.3.2 質(zhì)譜條件

使用iKnife智能刀切割帶魚,形成含有大量離子的氣溶膠,經(jīng)泵驅(qū)動,通過PTEE管引入質(zhì)譜儀中;以丙二醇-亮氨酸腦啡肽混合物為輔助溶劑,經(jīng)注射泵以0.1 mL/min的流量引入端口,用于清洗雜質(zhì)、提高信號強度、鎖定質(zhì)量校正;質(zhì)譜接口內(nèi)設(shè)Kanthal A1燈絲(1.1 ?,3 V,500 ℃)用作輔助碰撞電離,離子碰撞后進入質(zhì)譜儀StepWave裝置;質(zhì)譜儀掃描時間為1 s;質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 200;每個樣品切割5 次,以作平行;所有數(shù)據(jù)均以負電離模式收集。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將質(zhì)譜圖經(jīng)MassLynx 4.1進行峰匹配、濾噪、中心化和標準物質(zhì)校準處理,結(jié)果保存為Excel格式。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到主要離子峰的質(zhì)荷比和峰面積信息,結(jié)合Lipid MS Predictor脂質(zhì)分子數(shù)據(jù)庫比對確定或推測脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。采用峰面積歸一化方法計算所得脂質(zhì)的相對含量。平均值、標準差和顯著性水平均采用SPSS 21.0軟件計算,顯著性分析的置信區(qū)間為95%。采用SIMCA 14.1軟件將磷脂數(shù)據(jù)進一步處理,得到主成分分析(principal component analysis,PCA)散點圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 iKnife切割輸出功率的優(yōu)化

REIMS技術(shù)的原理是基于電刀在魚肉表面切割產(chǎn)生氣溶膠泵入質(zhì)譜儀進行鑒定分析,因此電刀的切割輸出功率對于組織表面脂質(zhì)離子化的效率有重要影響。本研究中以特征脂質(zhì)離子峰m/z 255.230 0、281.247 5、327.237 5、744.554 9、790.539 2的信噪比為指標優(yōu)化輸出功率,結(jié)果見圖1。

圖1 輸出功率對特征脂質(zhì)離子信噪比的影響Fig. 1 Effect of output power on the signal-to-noise ratio of representative lipid ions

一般來說,當功率較低時,信噪比較小,可能是由于能量偏低,帶魚魚肉表面化合物離子化不充分;當功率過高時,信噪比減小,主要是能量過高導致較多的基質(zhì)化合物產(chǎn)生,從而干擾目標離子。本研究中分別以5、10、15、20、25 W的輸出功率切割未經(jīng)油炸的帶魚原料,由圖1可知,在5～20 W的范圍內(nèi),信噪比隨輸出功率的增加而增大,在20 W時,達到最大值,隨后則呈下降趨勢。因此,本研究中設(shè)置電刀的切割輸出功率為20 W。

2.2 不同油炸溫度下脂肪酸組成分析

REIMS技術(shù)通過手持的iKnife對樣品表面離子化,無需任何樣品前處理,能夠?qū)崟r獲得質(zhì)譜輪廓圖。經(jīng)MassLynx 4.1去背景、中心化、校準等得到質(zhì)荷比和相應的峰面積,并結(jié)合Lipid MS Predictor比對獲得脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)。Yu Xina等[14]采用親水性相互作用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析甲魚的脂質(zhì)組學,總耗時大于1 h,包括大于40 min的樣品前處理和18 min的液相色譜梯度洗脫時間,整體步驟較為復雜。而REIMS技術(shù)數(shù)據(jù)采集時間為3 s左右,掃描時間大約為1 s,整個測定時間大致4 s,體現(xiàn)了快速、實時、高效的優(yōu)點。

圖2 iKnife-REIMS聯(lián)用技術(shù)實時獲取帶魚脂肪酸質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectra of fatty acids in lipids from hairtail using iKnife-REIMS

表1 未經(jīng)油炸和不同空氣油炸溫度下帶魚脂肪酸組成和相對含量Table 1 Composition and relative contents of fatty acids in lipids from hairtail air fried and not air fried at different temperatures

如圖2所示,質(zhì)荷比范圍為m/z200～500,各個峰分離度較好,信噪比較高幾乎看不到基質(zhì)峰。通過對該范圍內(nèi)的脂肪酸鑒定和積分,得到不同油炸溫度下和原料帶魚的脂肪酸組成及其相對含量,見表1。在4 種帶魚樣品共檢測出14 種脂肪酸,包括飽和脂肪酸(saturated fatty acids,SFA)3 種,單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA)2 種,其余均為多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)。其中相對含量最高的為DHA,原料、160、170 ℃和180 ℃油炸帶魚中的DHA相對含量分別為38.91%、33.43%、31.80%、30.74%;可以明顯看到,原料的DHA相對含量最高,隨著油炸溫度的升高,其相對含量逐漸降低,4 組樣品的DHA相對含量呈顯著差異(P＜0.05);主要由于高溫使PUFA氧化或者裂解[15]。EPA具有同樣趨勢,相對含量從原來的5.81%最低降至5.09%(180 ℃油炸)。這2 種PUFA是人體的必需脂肪酸,DHA俗稱“腦黃金”,EPA則被稱為“血管清道夫”,分別對大腦發(fā)育和心血管健康具有重要生理作用[16-17]。李楠楠等[18]提出以EPA和DHA的保存率為指標研究油炸對魚類營養(yǎng)價值的影響。經(jīng)180 ℃空氣油炸后,帶魚中EPA和DHA的保存率為80.12%;Gladyshav等[19-20]在相同溫度下對大馬哈魚進行普通油炸處理后,EPA和DHA的保存率為74.94%,相同條件下鱒魚的EPA和DHA平均保存率為78.77%;由此可見,空氣油炸下EPA和DHA的保存率略大于普通油炸,說明空氣油炸對于PUFA的氧化影響稍小于普通油炸。棕櫚酸(C16:0)是4 種樣品中含量第2高的脂肪酸,經(jīng)過180 ℃油炸的帶魚中棕櫚酸相對含量最高(20.51%),與原料(18.40%)呈顯著性差異(P＜0.05);可能是油炸溫度越高,棕櫚油酸(C16:1)轉(zhuǎn)成棕櫚酸越多?？偟膩碚f,SFA含量隨油炸溫度的升高呈現(xiàn)上升趨勢,PUFA與之相反;由于PUFA更易氧化,其轉(zhuǎn)化成MUFA的速率較快,而MUFA轉(zhuǎn)化成SFA的速率較慢,因此會產(chǎn)生MUFA含量增加現(xiàn)象,該結(jié)果與宋恭帥等[21]研究的不同貯藏溫度下魚油MUFA含量的變化趨勢一致。

2.3 空氣油炸溫度對磷脂組成成分的影響

圖3 iKnife-REIMS聯(lián)用技術(shù)實時獲取帶魚磷脂質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of phospholipids from hairtail using iKnife-REIMS

如圖3所示,各個峰的分離度較好。對該范圍內(nèi)的磷脂離子進行降噪和峰提取等處理,經(jīng)比對共鑒定出32 種磷脂分子,m/z范圍為673.481 4～957.549 9,結(jié)果見表2。磷脂是生物體內(nèi)重要的活性物質(zhì),不僅是細胞膜的主要成分,而且在改善血液循環(huán)、降血脂、細胞識別和提高人體免疫力等方面發(fā)揮重要的生理作用[22-23]。磷脂根據(jù)極性頭部基團的不同分為磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamines,PE)、磷脂酰膽堿(phosphatidyl cholines,PC)、磷脂酰肌醇(phosphatidyl inositols,PI)、甘油磷脂酸(phosphatidic acid,PA)和磷脂酰絲氨酸(phosphatidyl serines,PS)等[24]。由表2可知,4 種帶魚樣品中相對含量最多的磷脂分子形式為PE和PC,這與鄒舟等[25]研究鰱魚各部位磷脂組分的結(jié)果一致。帶魚中信號最強的離子峰為m/z790.539 2,經(jīng)鑒定為[PE C40:6-H]-,原料、160、170 ℃和180 ℃中相對含量依次為24.71%、24.31%、23.67%、23.06%,隨著油炸溫度的升高,相對含量不斷降低,不同樣品間呈顯著性差異(P＜0.05);其次為m/z744.554 9([PE C36:1-H]-),相對含量分別為13.50%、13.70%、14.06%、14.58%,相對含量隨油炸溫度的升高而提高,最高增加了1.08%?？傮w來說,升高油炸溫度,會使磷脂分子的不飽和度下降,主要是由于高溫油炸破壞了一部分的不飽和脂肪酸,使其發(fā)生氧化或加氫,從而飽和度提高[26-27]。

表2 未經(jīng)油炸和不同空氣油炸溫度下帶魚磷脂組成和相對含量Table 2 Composition and relative contents of phospholipids in hairtail air fried and not air fried at different temperatures

2.4 PCA結(jié)果

PCA是將n維特征映射到k維上,從而實現(xiàn)多個指標的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維,并對k維的特征向量進行線性變換,轉(zhuǎn)換后的變量則稱為主成分[28-29]。本研究采用SIMCA 14.1軟件對原料和不同空氣油炸溫度下的樣品中磷脂組成成分(32 種),共計20 個觀察組進行PCA,結(jié)果如圖4所示。PC1貢獻率較高,為64.3%,說明PC1能解釋64.3%的原有變量;PC2的貢獻率為14.3%;2 個主成分的累計貢獻率為78.6%,說明這2 個主成分能較好地反映原料和不同空氣油炸溫度下磷脂組成的特征信號[30-31]。由圖4可知,20 個帶魚樣品信息被分成4 個集群,分別為原料、160 、170、180 ℃油炸。未油炸的帶魚能和其他3 個油炸樣品明顯地區(qū)分,其中和180 ℃油炸樣品區(qū)別最大。經(jīng)REIMS技術(shù)測得的磷脂分子數(shù)據(jù)經(jīng)顯著性分析后,也可明顯地看到4 組樣品間一些特征離子峰具有顯著性差異(P＜0.05),通過PCA更好地驗證了之前的分析結(jié)果。由圖5可知,在置信區(qū)間為95%的情況下,PC1中m/z718.539 2、699.497 0、744.554 9三個離子所占的比重最大,說明這3 個變量對于形成PC1的貢獻最大,結(jié)合表2顯著性分析表明這3 個離子在區(qū)分樣品中起到重要作用。

圖4 未經(jīng)油炸和不同空氣油炸溫度下帶魚樣品PCA散點圖Fig. 4 PCA scatter plot for hairtail air fried and not air fried at different temperatures

圖5 PC1的載荷柱狀圖Fig. 5 Loadings bar plot of PC1

2.5 方法驗證

本研究選取m/z255.230 0、281.247 5、327.237 5、744.554 9、790.539 2為特征離子,以未經(jīng)油炸的帶魚作為代表樣品對REIMS檢測方法進行驗證,結(jié)果如表3所示。該方法的精密度通過日內(nèi)和日間精密度衡量,使用電刀在相同的輸出功率下平行切割帶魚魚肉表面5 次,分別計算特征離子相對含量,并得到平均值和日內(nèi)精密度;在相同條件下連續(xù)平行測試3 d,獲得特征離子相對含量的平均值和日間精密度。由表3可知,該方法日內(nèi)精密度為2.23%～4.06%,日間精密度為3.04%～6.18%,結(jié)果顯示此方法精密度和重復性較高。

表3 iKnife-REIMS聯(lián)用技術(shù)檢測方法驗證Table 3Validation of iKnife-REIMS

3 結(jié) 論

本研究基于iKnife-REIMS技術(shù)獲得未經(jīng)油炸和不同空氣油炸溫度下帶魚樣品的實時脂質(zhì)組成。在獲得最佳電刀輸出功率20 W的基礎(chǔ)上,探究空氣油炸溫度對脂肪酸和磷脂含量的影響,成功檢測出14 種脂肪酸和32 種磷脂分子形式。其中相對含量最高的脂肪酸為DHA,相對含量最多的磷脂分子形式為PE和PC,信號最強的磷脂離子峰為m/z790.539 2?？傮w來說,脂質(zhì)分子的飽和度隨著油炸溫度的升高而提高。將20 組樣品進行PCA,得到PC1和PC2的累計貢獻率為78.6%,并獲得4 個明顯的集群。選取特征離子對iKnife-REIMS檢測方法進行驗證,結(jié)果顯示此方法精密度和重復性較好。本研究采用的新型質(zhì)譜檢測技術(shù)具有快速、高效和實時等優(yōu)點,在海洋食品等領(lǐng)域具有廣泛前景。