馬俊美,王 敬,孫文毅,蔣 杰,李 強(qiáng),范素芳

(河北省食品檢驗(yàn)研究院,河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050091)

保健食品能調(diào)節(jié)人體機(jī)能,是對(duì)人們正常膳食的有益補(bǔ)充[1],隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和亞健康人群的增加,保健食品市場(chǎng)銷量與日俱增。近年來(lái)該行業(yè)持續(xù)發(fā)酵,呈現(xiàn)較為混亂的局面[2],一些不法商家為突出功效,吸引消費(fèi)者,謀取高額利潤(rùn),在產(chǎn)品中非法添加短期內(nèi)見(jiàn)效快、成本低廉、副作用大的化學(xué)藥物[3-4],為消費(fèi)者的健康埋下了隱患。其中補(bǔ)腎壯陽(yáng)類保健品是非法添加的重災(zāi)區(qū),非法添加的壯陽(yáng)類藥物主要是以西地那非為代表的那非類物質(zhì)[5-6],該類化合物將給消費(fèi)者帶來(lái)嚴(yán)重的健康威脅,產(chǎn)生心律失常、心肌梗死、心臟猝死、腦血管出血、高血壓等嚴(yán)重不良反應(yīng)[7-9],患有高血壓等心血管疾病和糖尿病患者在不知情的情況下服用這些非法添加化學(xué)成分的藥物甚至?xí)?dǎo)致死亡[10]。

目前,保健食品中那非類物質(zhì)的檢測(cè)方法有薄層色譜法[11-12]、液相色譜法[13-16]、液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[17-21]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[22-26]等。其中,薄層色譜法前處理復(fù)雜,干擾大且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性;液相色譜法檢測(cè)的物質(zhì)較單一,且檢出限較高。隨著分析檢測(cè)技術(shù)和分析儀器的不斷發(fā)展,具有高選擇性和高靈敏度,且定量準(zhǔn)確,操作簡(jiǎn)便的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法得到廣泛應(yīng)用[27-28],己成為那非類物質(zhì)的主要檢測(cè)方法[29-31]。目前,基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)那非類物質(zhì)的種類較少(30 種以下),不夠全面,檢測(cè)30 種以上那非類物質(zhì)均采用高分辨質(zhì)譜法,側(cè)重于定性篩查[32]。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,建立可能被添加的90 種那非類物質(zhì)的測(cè)定方法,該方法前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好,適合大批量樣品中那非類物質(zhì)的快速測(cè)定,不僅為開(kāi)展食品檢驗(yàn)工作提供技術(shù)支撐,也對(duì)打擊制、售假冒偽劣保健食品,凈化保健食品市場(chǎng)產(chǎn)生重要影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

固態(tài)和液態(tài)保健食品 市售。

甲醇、乙腈、甲酸(均為色譜純) 德國(guó)默克公司;超純水 廣州屈臣氏公司;90 種那非類藥物混標(biāo)(20 μg/mL) 北京曼哈格生物科技有限公司。

Triple Quad 6500+液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源及MultiQuant3.0.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)) 美國(guó)Sciex公司;3K13離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;Vortex Genius 3渦旋儀 德國(guó)IKA公司;Elmasonic P300H超聲波清洗器德國(guó)Elma公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

固態(tài)試樣混勻研細(xì),液態(tài)試樣搖勻后,準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品于25 mL容量瓶中,加入20 mL甲醇,超聲提取15 min,放置室溫后,用甲醇定容,轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,9 500 r/min離心2 min,上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,取濾液,根據(jù)實(shí)際濃度用甲醇適當(dāng)稀釋至線性范圍內(nèi),待測(cè)。

1.2.2 色譜條件

XBridge BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,2.5 μm);流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液,B為乙腈;進(jìn)樣體積5.0 μL;柱溫40 ℃;流速0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0～2.00 min,90% A,10% B;2.00～16.00 min,90%～35% A,10%～65% B;16.00～19.00 min,35%～2% A,65%～98% B;19.00～22.00 min,2% A,98% B;22.00～22.10 min,2%～90% A,98%～10% B;22.10～25.00 min,90% A,10% B。

1.2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);離子噴霧電壓4 500 V/-4 500 V;霧化器壓力50 psi;輔助氣壓力50 psi;氣簾氣壓力30 psi;碰撞氣壓力9 psi;離子源溫度500 ℃。監(jiān)測(cè)離子及質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 分析物的質(zhì)譜信息Table 1 Mass spectrometry parameters of analytes

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

以針泵進(jìn)樣的方式,以5 μL/min的流速向質(zhì)譜儀中注入100 ng/mL那非類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,確定其最佳質(zhì)譜條件。分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行一級(jí)全掃描,確定目標(biāo)化合物的母離子質(zhì)量數(shù)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),除脫哌嗪基硫代西地那非和伐地那非二聚體在負(fù)離子模式下的靈敏度遠(yuǎn)高于正離子模式外,其余88 種那非類物質(zhì)均在正模式下的響應(yīng)更高,這是由于這些物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)中均含有仲胺或叔胺等基團(tuán),適合正電離模式。確定目標(biāo)化合物的母離子后,對(duì)母離子進(jìn)行子離子全掃描,確定其定性和定量離子。優(yōu)化子離子的去簇電壓,碰撞能量等參數(shù)。目標(biāo)化合物的定性和定量離子對(duì)的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

采用正、負(fù)2 種離子模式采集,實(shí)驗(yàn)對(duì)比了分別在乙腈-水、甲醇-水流動(dòng)相體系中不添加與添加0.1%甲酸、氨水時(shí),90 種那非類物質(zhì)的色譜峰形和離子化程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用0.1%甲酸-乙腈體系時(shí),90 種那非類物質(zhì)的離子化效果普遍較好且峰形最佳,這是由于90 種那非類物質(zhì)中除脫哌嗪基硫代西地那非、伐地那非二聚體外,其余均采用正離子模式采集,加入適量的甲酸會(huì)促進(jìn)胺的電離,從而提高離子化效率,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用0.1%甲酸-乙腈體系作為流動(dòng)相。

2.2.2 色譜柱的選擇

90 種那非類物質(zhì)中,母離子相同二級(jí)子離子相同或部分相同的同分異構(gòu)體共有8 組,分別為母離子m/z357.2的那非乙酰酸和那莫伐地那非;母離子m/z438.2的苯噻啶紅地那非和伐地那非乙?；愃莆?母離子m/z467.3的紅地那非、二甲基紅地那非和乙酰伐地那非;母離子m/z475.2的伐地那非哌嗪酮和N-去乙基-N-甲基伐地那非;母離子m/z489.2的艾地那非、豪莫西地那非、伐地那非、丙氧苯基西地那非和異丁基西地那非;母離子m/z505.2的羥基伐地那非和伐地那非N-氧化物;母離子m/z519.2的丙氧苯基羥基豪莫西地那非、丙氧苯基硫代艾地那非和丙氧苯基硫代豪莫西地那非;母離子m/z521.2的羥基硫代豪莫西地那非和羥基硫代伐地那非。

為使每種目標(biāo)物都有較好的峰形和分離效果,本實(shí)驗(yàn)選擇質(zhì)量濃度為20 ng/mL的90 種那非類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,在相同的流動(dòng)相和洗脫程序下,分別采用Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、XBridge BEH Shield RP18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.5 μ m) 、 T h e r m o A c c u c o r e a Q C18色 譜 柱(2.1 mm×100 mm,2.6 μm)、Hypersil Gold C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.9 μm)進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:使用Thermo Accucorea Q C18和Hypersil Gold C18色譜柱時(shí),豪莫西地那非和伐地那非不能分離,使用XBridge BEH Shield RP18色譜柱時(shí)育亨賓出峰稍有拖尾,使用Waters Acquity BEH C18色譜柱時(shí),色譜峰峰形良好,且8 組同分異構(gòu)體(圖1)分離效果較為理想,故實(shí)驗(yàn)選擇Waters Acquity BEH C18色譜柱進(jìn)行分離。

圖18 組同分異構(gòu)體的液相色譜-質(zhì)譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of 8 sets of isomers

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

90 種那非類物質(zhì)均難容或不溶于水,易溶于極性有機(jī)溶劑,實(shí)驗(yàn)對(duì)比目標(biāo)物添加量為50 μg/kg時(shí),甲醇、乙腈和乙醇3 種溶劑的提取效果。結(jié)果表明:采用甲醇和乙腈作為提取溶劑的效果優(yōu)于乙醇,二者提取結(jié)果基本一致,綜合考慮溶劑毒性、成本等問(wèn)題,最終選用甲醇作為提取溶劑。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限結(jié)果

用上述優(yōu)化的條件對(duì)保健食品中90 種那非類物質(zhì)進(jìn)行定量分析,用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液,得到系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以目標(biāo)物定量離子的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y),目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)作線性回歸方程,以3 倍和10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的空白樣品添加質(zhì)量濃度作為檢出限和定量限。如表2所示,90 種那非類物質(zhì)在0.2～50 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.995,線性關(guān)系良好。檢出限為2.5～25.0 μg/kg,定量限為5.0～50.0 μg/kg,遠(yuǎn)低于現(xiàn)有文獻(xiàn)方法與標(biāo)準(zhǔn)方法(BJS 201805)。

表2 90 種化合物的線性關(guān)系、檢出限、定量限Table 2 Linear relationships, LODs and LOQs of 90 compounds

續(xù)表2

續(xù)表2

2.5 回收率和精密度結(jié)果

在固態(tài)、液態(tài)空白基質(zhì)中添加90 種那非類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液制成陽(yáng)性樣品,添加水平分別為1 倍定量限、3 倍定量限和10 倍定量限,每個(gè)添加水平進(jìn)行6 次重復(fù)實(shí)驗(yàn),計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations,RSD),回收率結(jié)果見(jiàn)表3。添加量為5.0～500 μg/kg時(shí),90 種那非在固態(tài)樣品中回收率為78.0%～109.9%,RSD為0.20%～9.96%,在液態(tài)樣品中回收率為80.5%～109.8%,RSD為1.25%～7.34%,符合檢驗(yàn)方法要求。

表3 90 種化合物的回收率Table 3 Spiked recoveries of the 90 compounds%

續(xù)表3%

續(xù)表3 %

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用本研究建立的方法對(duì)市場(chǎng)以及網(wǎng)上購(gòu)買(mǎi)的10 批次固態(tài)和液態(tài)保健食品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1 批次保健酒樣品檢測(cè)出含有西地那非(2.83×105μg/kg)、1 批次片劑樣品檢測(cè)出含有他達(dá)拉非(3.85×106μg/kg)。

3 結(jié) 論

本研究建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)保健食品中90 種那非類物質(zhì)的分析方法,并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。該方法簡(jiǎn)單高效、選擇性好、靈敏度高,滿足大量保健品中那非類物質(zhì)快速、準(zhǔn)確定量的需要。可為基質(zhì)中那非類物質(zhì)的檢測(cè)提供方法參考,也可為打擊保健食品行業(yè)非法添加化學(xué)藥物行為提供有利依據(jù)。