萬譯文，楊 霄*，黃向榮，索紋紋，何 詠，曾春芳

(1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長沙 410153；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000；3.農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(長沙)，湖南長沙 410153)

原多甲藻酸(Azaspiracids，AZAs)貝類毒素于1995年發(fā)現(xiàn)自愛爾蘭的紫貽貝(Mytilusedulis)中，它們是一類脂溶性聚醚生物毒素[1]，具有一個獨特的螺旋環(huán)和一個脂肪族羧酸基，屬氨代螺旋酸類貝類毒素。目前共發(fā)現(xiàn)32種AZAs的同系物，已確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的有11種，其中最常見且毒性最大的分別為AZA1、AZA2及AZA3 3種[2，3]。AZAs貝類毒素比較穩(wěn)定，在酸性、堿性和高溫條件都不能使其毒性降低，人食用含有AZAs貝類毒素后會發(fā)生胃腸道紊亂，主要的中毒癥狀有惡心、嘔吐、腹瀉、胃痙攣等。2002年，歐盟規(guī)定雙殼類水產(chǎn)品中AZA1，AZA2和AZA3的最大允許濃度為160 μg/kg(以貝肉計)[4]。

目前，AZAs貝類毒素的檢測方法主要有生物測試法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。生物測試法只能測定毒素總量，靈敏度和準確度均欠佳，可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果而導(dǎo)致無法對其準確定性定量[5]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)具有靈敏度高、特異性強的特點，因此，人們開始重點研究建立分析AZAs貝類毒素的液相色譜-質(zhì)譜分析方法，并對AZAs貝類毒素的分布地域和范圍進行調(diào)查研究[6 - 8]。貝類產(chǎn)品基質(zhì)較為復(fù)雜，目前已報道的AZAs貝類毒素的樣品前處理方法多為C18和功能性聚合物吸附劑填充的固相萃取柱[9，10]或基質(zhì)分散固相萃取技術(shù)[11 - 14]。管尖固相萃取(Pipette Tip Solid-phase Extraction，PT-SPE)是一種新型的小型化固相萃取技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的固相萃取，其具有萃取裝置制作簡單、成本低，吸附劑選擇范圍寬，萃取吸附劑和溶劑用量少，萃取效率高等優(yōu)點，近年來在復(fù)雜基質(zhì)樣品前處理中引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注[15-17]。

石墨烯(Graphene)是一種新型二維平面碳納米材料，由于其具有大的比表面積、大的共軛體系、很強的疏水性和化學(xué)穩(wěn)定性等特點，得到廣泛應(yīng)用[18-20]。近年來，一些研究者將石墨烯吸附劑與管尖固相萃取技術(shù)的特點相結(jié)合，設(shè)計制作了簡單、高效的小型化固相萃取裝置，并成功應(yīng)用于貝類產(chǎn)品[15]、牛奶[16]、豆芽[21]、果汁[22]、人血漿[23]、減肥補充劑[23]等復(fù)雜基質(zhì)樣品中目標化合物的分析檢測。本實驗將石墨烯和管尖固相萃取(G -PT-SPE)技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于貝類樣品前處理的凈化過程，結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)，建立了一種簡單、快速測定貝類中3種AZAs貝類毒素的分析方法，并成功應(yīng)用于實際貝類樣品的分離檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Quantum Access高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Thermo Fisher Scientific公司)；氮吹儀(美國，Organomation公司)；高速冷凍離心機(日本，日立公司)；漩渦振蕩器(美國，F(xiàn)isher公司)；超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；中沃超純水儀(中沃水務(wù)環(huán)?？萍加邢薰?。

AZA1(CRM-AZA1-b,1.30±0.07 μg/mL)、AZA2(CRM-AZA2-b,1.22±0.06 μg/mL)、AZA3(CRM-AZA3,1.04±0.04 μg/mL)標準溶液均購自加拿大海洋生物科學(xué)研究所(NRC)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷(色譜純，德國Merck公司)；二氯甲烷(色譜純，天津市科密歐試劑有限公司)；甲酸(色譜-質(zhì)譜純，美國Sigma公司)；石墨烯(厚度:～1 nm，片徑:1～100 μm)購自南京吉倉納米科技有限公司。實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

貝類樣品主要包括僧帽牡蠣(Saccostreacucullata)、紫貽貝(Mytilusedulis)和毛蚶(Scapharcasubcrenata)，于2017年6月到9月采自福建省福州、漳州、廈門的貝類養(yǎng)殖戶和水產(chǎn)品市場。貝類樣品運至實驗室后用水洗凈，開殼取其貝肉，瀝干水分，勻漿，于-18 ℃冷凍保存。

1.2 標準溶液的配制

準確移取適量的3種貝類毒素標準品溶液，用甲醇配制成質(zhì)量濃度均為0.125 mg/L的AZA1、AZA2和AZA3混合標準溶液。

1.3 樣品處理

1.3.1 提取稱取2.0 g(±0.02 g)樣品于50 mL離心管中，加入9 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，超聲提取5 min，8 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至20 mL玻璃管中。重復(fù)上述操作，合并上清液，用甲醇定容至20 mL。吸取上述提取液5 mL至玻璃管中，于40～50 ℃下氮吹至約0.5 mL，用 2 mL正己烷脫脂兩次，棄去正己烷層。加入2 mL乙酸乙酯后，旋渦1 min進行萃取，以6 000 r/min 離心 5 min，重復(fù)上述操作，合并乙酸乙酯層后，于40～50 ℃用氮氣吹干。加入150 μL的甲醇溶解殘渣，再加入850 μL的水，渦旋混勻1 min，10 000 r/min離心5 min，待凈化。

1.3.2 G -PT-SPE裝置組裝及凈化過程實驗室自制的G -PT-SPE裝置組裝過程如下[25]：取200 μL、1 mL移液槍頭各一個，用甲醇和水洗滌干凈后于室溫下晾干。然后根據(jù)200 μL移液槍頭的形狀特點在槍頭末端一固定的位置填充適量的脫脂棉，稱取1.0 mg石墨烯粉末填裝到200 μL槍頭中，再往槍頭石墨烯層上端填充適量的脫脂棉。然后根據(jù)1 mL移液槍頭的形狀特點在槍頭下端一固定位置切去一段，并將其插入到上述200 μL槍頭上端。組裝好的G -PT-SPE裝置中石墨烯材料在管尖處的裝填高度約為1 cm。凈化過程如下：依次用1 mL甲醇和1 mL水預(yù)處理小柱，然后加入提取液，再用1 mL 10%的甲醇水溶液淋洗，最后用1 mL 1%的氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，用甲醇定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，濾液供HPLC-MS/MS法測定。

1.4 空白基質(zhì)標準曲線的繪制

取空白基質(zhì)樣品，按1.3節(jié)的樣品前處理方法制備空白基質(zhì)溶液，添加適量1.2節(jié)中配制的混合標準溶液，配制成AZA1、AZA2和AZA3的濃度均為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/kg的基質(zhì)標準系列工作溶液，并分別上機測定。以被測組分的峰面積(y)為縱坐標，質(zhì)量濃度(x,μg/kg)為橫坐標，繪制空白基質(zhì)標準曲線。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件:Kinetex XB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)；流動相A為超純水(含2 mmol/L甲酸銨，50 mmol/L甲酸)；流動相B為95%乙腈溶液(含2 mmol/L甲酸銨，50 mmol/L甲酸)；梯度洗脫程序：0～7.0 min,20%～90%B;7.0～10.0 min,90%B；10.0～12.0 min,20%B。流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式；噴霧電壓3 500 V；離子傳輸毛細管溫度350 ℃；蒸發(fā)溫度300 ℃；鞘氣壓力為276 kPa，輔助氣壓力為69 kPa，碰撞氣壓力199.983 mPa。優(yōu)化后的其它質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 3種原多甲藻酸貝類毒素的質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇和優(yōu)化

采用流動注射進樣方式，以10 μL/min的流速，將1.2節(jié)配制的混合標準溶液注入離子源中。在正離子模式下對AZAs進行一級質(zhì)譜掃描，獲得目標物的分子離子峰[M+H]+，以各化合物的[M+H]+為母離子，優(yōu)化噴霧電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力、離子傳輸毛細管溫度等參數(shù)。然后利用二級質(zhì)譜全掃描收集各組分母離子對應(yīng)的的子離子信息，分別從中選取相對豐度最強和次強的子離子作為各自的定量離子和定性離子，并優(yōu)化碰撞能。最終確定1.5節(jié)所述的質(zhì)譜條件。

2.2 色譜條件的確定

色譜條件參見文獻報道[9，10]。選用Kinetex XB-C18色譜柱對AZAs貝類毒素進行分離，以含有50 mmol/L甲酸、2 mmol/L 甲酸銨的水溶液和乙腈-水(95∶5，V/V)溶液作為流動相，梯度洗脫。結(jié)果表明，3種AZAs貝類毒素均具有較高的靈敏度和選擇性，且峰形尖銳，3種AZAs貝類毒素的SRM色譜圖見圖1。

圖1 3種原多甲藻酸貝類毒素的選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)色譜圖Fig.1 SRM chromatograms of three AZAs

2.3 提取條件的選擇

用于提取貝類產(chǎn)品目標組分的溶劑有甲醇、80%甲醇水溶液、90%甲醇水溶液、二氯甲烷等[9，26]。本實驗通過在空白牡蠣中添加同一水平的貝類毒素后，分別對甲醇、80%甲醇水溶液、90%甲醇水溶液、二氯甲烷四種提取劑的提取效果進行考察。結(jié)果表明，二氯甲烷的提取液很渾濁且有懸浮物，不利于進一步凈化。甲醇具有較強的提取AZAs的能力，但得到的提取液含大量雜質(zhì)，對隨后的富集凈化帶來挑戰(zhàn)，且對目標物離子碎片豐度產(chǎn)生一定影響。采用80%和90%甲醇水溶液作提取劑時，兩者對AZA1、AZA2、AZA3的提取率均較高，回收率在85%以上，可以滿足3種目標毒素同時檢測要求，且提取液中含有的雜質(zhì)較少，有利于進一步的凈化。考慮到90%甲醇水溶液的揮發(fā)速率大于80%甲醇水溶液，氮吹時較易濃縮，故本實驗選用90%甲醇水溶液為提取溶劑。

2.4 凈化條件的選擇

貝類樣品基質(zhì)復(fù)雜，貝肉中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、色素等物質(zhì)，故需要對粗提液做進一步凈化處理。貝類樣品經(jīng)90%甲醇水溶液沉淀蛋白后，高速離心去除大部分的蛋白質(zhì)，提取液氮吹后再經(jīng)正己烷萃取2次，可有效去除大部分脂肪，有利于后續(xù)凈化過程。

在液-液萃取實驗中，分別以二氯甲烷和乙酸乙酯為萃取劑，發(fā)現(xiàn)兩種溶劑均可將毒素從甲醇水溶液中萃取出來，同時能去除部分脂肪和色素?？紤]到乙酸乙酯的毒性更小，本研究選擇乙酸乙酯為萃取劑。

為了考察G -PT-SPE的凈化效果，采用樣品提取液過柱和不過柱相比較的結(jié)果進行評價，具體評價方法為：取兩份空白試樣，添加同一水平的貝類毒素(5.0 μg/kg)后，一份按1.3.1的方法處理后上機分析，另一份按1.3.1和1.3.2的方法處理后上機分析。實驗結(jié)果表明：提取液經(jīng)G -PT-SPE凈化后，溶液顏色較淺，且各目標物色譜峰面積比未過柱樣品大約11%～15%。這說明提取液經(jīng)G -PT-SPE進一步凈化后可以去除部分色素和其他可能的干擾物質(zhì)(如中小分子雜質(zhì)等)，從而降低了基質(zhì)對毒素的抑制效應(yīng)。

2.5 G -PT-SPE條件的優(yōu)化

為了獲得較高的萃取回收率，實驗對影響G -PT-SPE的條件(石墨烯的用量、淋洗劑的種類和用量、洗脫劑的種類和用量)進行了優(yōu)化。

2.5.1 石墨烯的用量考察了不同用量的石墨烯對3種毒素的萃取回收率的影響。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)石墨烯的用量從0.5 mg增加到1.0 mg時，各組分回收率都有明顯增大；繼續(xù)增加石墨烯的用量，各組分回收率無明顯變化。因此，選擇1.0 mg石墨烯作為最佳的吸附劑用量。

圖2 石墨烯用量對3種原多甲藻酸貝類毒素回收率的影響(n=3)Fig.2 Effect of amount of graphene on the recoveries of three AZAs(n=3)

2.5.2 淋洗劑的種類和用量固相萃取的淋洗步驟可以有效地去除樣品粗提液中共吸附的干擾雜質(zhì)。本實驗考察了不同種類淋洗劑對目標物回收率的影響。實驗中選取甲醇、甲醇-水溶液(1∶1，V/V)、甲醇-水溶液(1∶4，V/V)、甲醇-水溶液(1∶9，V/V)以及水作為淋洗劑，考察其對目標組分的提取回收率的影響。實驗結(jié)果表明，甲醇和甲醇-水溶液(1∶1，V/V)作為淋洗劑會造成所有目標組分很大程度的損失，回收率僅為5%～30%，甲醇-水溶液(1∶4，V/V)作為淋洗劑時各目標組分都有一定程度的損失，回收率為74%～82%，而甲醇-水溶液(1∶9，V/V)和水作為淋洗劑所有目標物均可獲得較高的回收率，回收率為85%～95%。考慮到甲醇-水溶液(1∶9，V/V)作為淋洗劑比水更容易凈化一些目標物的共吸附雜質(zhì)，最終實驗選擇甲醇-水溶液(1∶9，V/V)作為淋洗劑。

同時實驗還考察了甲醇-水溶液(1∶9，V/V)的用量(0.5～2.0 mL)對目標物回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.0 mL的甲醇-水溶液(1∶9，V/V)即可獲得較好的淋洗效果且不會對目標物的回收率造成影響。因此，本實驗選擇1.0 mL的甲醇-水溶液(1∶9，V/V)作為淋洗劑。

2.5.3 洗脫劑的種類和用量洗脫條件的選擇對整個固相萃取過程至關(guān)重要。貝類毒素在石墨烯吸附劑上的保留能力與毒素的親脂特性、極性以及所帶電荷狀態(tài)有關(guān)，因此洗脫劑的酸堿性對貝類毒素在固相萃取柱上的洗脫效果特別重要[15]。本實驗重點考察了1%的甲酸甲醇溶液、甲醇以及1%的氨水甲醇溶液作為洗脫劑時對毒素回收率的影響，結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出，AZA1、AZA2、AZA3在堿性條件(回收率為86%～94%)的洗脫效果明顯優(yōu)于酸性和中性條件(回收率為75%～83%)。這可能的原因是AZAs分子結(jié)構(gòu)中帶有羧基而呈現(xiàn)酸性，堿性條件有利于AZAs離子化，進而降低了其與石墨烯表面的親和力，對洗脫更加有利[10,16]。為確保分析物被洗脫完全且不浪費洗脫劑，實驗對洗脫劑的體積進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)1.0 mL的洗脫劑即可將3種AZAs貝類毒素洗脫完全。因此，本實驗選擇1.0 mL 1%的氨水甲醇溶液作為洗脫劑。

圖3 不同種類的洗脫劑對3種原多甲藻酸貝類毒素回收率的影響(n=3)Fig.3 Effect of different types of elution solvents on the recoveries of three AZAs(n=3)

2.6 方法學(xué)驗證

2.6.1 線性范圍和靈敏度為了降低基質(zhì)效應(yīng)對AZAs貝類毒素定量造成的影響，本實驗按照1.4節(jié)的方法制作基質(zhì)標準曲線。根據(jù)信噪比(S/N)=10確定目標物的定量限(LOQ)。樣品中3種AZAs貝類毒素的LOQ均為1.0 μg/kg。表2列出了3種AZAs貝類毒素的線性范圍、基質(zhì)標準曲線、相關(guān)系數(shù)、定量限。由表2可知，3種AZAs貝類毒素的線性關(guān)系良好，靈敏度較高。說明本方法適用于3種AZAs貝類毒素的定量分析。

表2 3種原多甲藻酸貝類毒素的線性范圍、基質(zhì)標準曲線、相關(guān)系數(shù)和定量限

2.6.2 準確度和精密度選取陰性牡蠣作為空白基質(zhì)樣品，分別添加3個濃度水平的AZAs貝類毒素混合標準溶液，每個濃度水平做6個平行樣，按本方法進行準確度和精密度實驗。結(jié)果如表3所示，AZA1、AZA2和AZA3的回收率為78.5%～102%，相對標準偏差(RSD)為3.25%～13.2%。表明該方法的準確度高，重復(fù)性好，滿足3種AZAs貝類毒素的日常檢測要求。

表3 空白樣品添加3種原多甲藻酸貝類毒素的回收率和精密度(n=6)

2.7 與其他方法比較

將本實驗建立的G -PT-SPE結(jié)合HPLC-MS/MS分離分析AZAs貝類毒素的方法與國內(nèi)外已報道的檢測方法進行對比(表4)。本實驗建立的方法具有線性范圍寬、靈敏度和準確度高等優(yōu)點。更為重要的是，本實驗建立的方法吸附劑用量更少，成本更低。這表明基于石墨烯的管尖固相萃取技術(shù)具有較好的應(yīng)用前景，可以作為一種用于提取貝類中AZAs貝類毒素的簡便、快速、低成本的樣品前處理方法。

表4 與其他檢測原多甲藻酸貝類毒素的方法對比

(續(xù)表4)

2.8 實際樣品檢測

采用已經(jīng)建立的方法對30個貝類樣品進行分析檢測，均未檢出AZAs貝類毒素。

3 結(jié)論

本實驗以自制的石墨烯-管尖固相萃取裝置對貝類樣品中3種AZAs貝類毒素進行萃取凈化處理，通過對石墨烯用量、淋洗劑種類和用量、洗脫劑種類和用量等影響固相萃取的條件進行優(yōu)化，建立起一種石墨烯-管尖固相萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定貝類樣品中3種AZAs貝類毒素的方法。本實驗建立的方法簡單、經(jīng)濟、高效，適用于實際貝類樣品中3種AZAs貝類毒素的檢測，拓展了石墨烯在復(fù)雜生物基質(zhì)樣品前處理領(lǐng)域的應(yīng)用。