劉劍偉　蔣衛(wèi)平

【摘要】 關(guān)節(jié)軟骨缺損的再生修復(fù)是現(xiàn)代骨科臨床面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。由于軟骨組織的無血管性質(zhì)，其再生或修復(fù)能力有限，因此需要適當(dāng)?shù)牟牧舷到y(tǒng)，在物理、機械、組織學(xué)和生物學(xué)方面重新調(diào)整天然軟骨組織的功能，促進軟骨再生。目前包括基因治療在內(nèi)的組織工程技術(shù)正在成為軟骨治療的關(guān)鍵方法之一，并且為許多軟骨創(chuàng)傷和疾病的治療帶來了新的曙光和更好的結(jié)果。本文綜述和總結(jié)了組織工程技術(shù)在治療關(guān)節(jié)軟骨缺損方面的研究進展。

【關(guān)鍵詞】 組織工程 修復(fù) 關(guān)節(jié)軟骨缺損

[Abstract] The regeneration and repair of articular cartilage defects is one of the great challenges faced by clinicians. Due to the vaseless nature of cartilage tissue， its ability to regenerate or repair is limited， and appropriate material systems are needed to facilitate cartilage regeneration by physically， mechanically， histologically， and biologically readjusting the function of natural cartilage tissue. At present， tissue engineering techniques including gene therapy are becoming one of the key methods of cartilage therapy and bringing new light and better results to the treatment of many cartilage injuries and diseases. This paper reviews the progress of tissue engineering in the treatment of articular cartilage defects.

[Key words] Tissue engineering Repair Articular cartilage defect

First-authors address： Nanning Second Peoples Hospital， Nanning 530031， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.17.041

關(guān)節(jié)炎及外傷所致的軟骨缺損常常導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛，由于軟骨組織本身的無血管特性，軟骨缺損后常常難以自身修復(fù)，因此軟骨缺損目前已成為臨床治療的難題之一[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)雖然軟骨移植術(shù)能促進關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)但是仍然面臨許多需要解決的問題。例如：自體軟骨移植術(shù)后創(chuàng)面再生修復(fù)的軟骨組織生物力學(xué)強度較低并且易于發(fā)生退變[2]，而同種異體軟骨移植則面臨著異體軟骨組織的強烈免疫源性排斥以及移植物易于吸收、塌陷[3]。因此至今難以找到一種完美的生物組織材料能達到天然軟骨水平。隨著組織工程、生物材料技術(shù)日新月異的進步發(fā)展，為臨床治療軟骨缺損相關(guān)疾病指明了新方向。在這篇綜述中，筆者概述了組織工程技術(shù)在骨軟骨再生治療過程中的背景和意義及其面臨的挑戰(zhàn)。

1 軟骨疾病及治療

常見軟骨相關(guān)疾病包括骨關(guān)節(jié)炎、軟骨發(fā)育不全、肋軟骨炎等。其中骨關(guān)節(jié)炎是一種最常見的軟骨相關(guān)疾病，骨關(guān)節(jié)炎好發(fā)于人體髖膝關(guān)節(jié)，尤其以老年人常見，是導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛活動受限的常見疾病[4-5]。

對軟骨相關(guān)疾病的治療方法必須考慮：發(fā)病部位、關(guān)節(jié)受損的范圍、病程的長短以及患者的年齡、身體狀況[6]。目前的治療方法包括：口服藥物對癥治療、局部穿刺注射藥物、微創(chuàng)手術(shù)固定、修復(fù)技術(shù)及組織工程再生技術(shù)等。組織工程技術(shù)修復(fù)缺損需要填充外來材料，實際上，這相當(dāng)于重建組織的連續(xù)性[7]。組織工程修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷這項技術(shù)的問世，為丟失的組織提供了替代品，已經(jīng)打破了“關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷，不可恢復(fù)”這一傳統(tǒng)觀念，為關(guān)節(jié)軟骨缺損的治療提供了令人興奮的前景。

2 細胞支架

細胞支架作為組織工程關(guān)鍵要素之一應(yīng)具有較低的細胞毒性、適宜的生物降解率和良好的生物力學(xué)強度以及適宜的孔隙率和孔徑結(jié)構(gòu)等[8]。細胞支架根據(jù)其來源可分為天然和合成材料。

2.1 天然生物材料 研究發(fā)現(xiàn)天然生物材料擁有免疫原性低、生物相容性好等優(yōu)勢，具有較好的生物可降解性。殼聚糖、膠原水凝膠、β-磷酸鈣為組織工程修復(fù)技術(shù)常用的天然生物材[9]。大量研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖水凝膠常用于軟骨組織工程促進軟骨組織再生修復(fù)并且能加快GAG的生成[10]。Hao等[11]研究發(fā)現(xiàn)：用殼聚糖水凝膠移植修復(fù)體內(nèi)軟骨缺損取得了良好的效果，經(jīng)過隨訪觀察軟骨創(chuàng)面可見透明軟骨填充。除此之外膠原、透明質(zhì)酸和纖維蛋白也常常被臨床醫(yī)生用于軟骨修復(fù)重建[12]。實驗證實，膠原支架能夠被軟骨細胞識別，促進軟骨細胞增殖[13-14]。將間充質(zhì)干細胞與Ⅱ型膠原支架混合培養(yǎng)后移植修復(fù)軟骨缺損，在缺損修復(fù)區(qū)有類軟骨細胞和細胞外基質(zhì)形成，局部無炎癥反應(yīng)[15]。通常天然生物材料較弱的力學(xué)性能限制了其在臨床上應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)軟骨組織再生修復(fù)，因此可通過與其他生物材料結(jié)合使用來提高天然生物材料的力學(xué)強度。膠原蛋白的力學(xué)機械性能弱于天然軟骨，然而通過添加β-磷酸鈣來創(chuàng)建復(fù)合材料，其力學(xué)機械性能得到了明顯的改善[16]。

2.2 合成生物材料 人工合成生物材料包括聚乙二醇（PEG）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）、聚乙烯醇（PVA）、聚己內(nèi)酯。人工合成生物材料通過材料聚合度的調(diào)控，改變其力學(xué)性能、內(nèi)在結(jié)構(gòu)等，從而能夠滿足骨軟骨修復(fù)的具體需求。研究表明聚乙二醇與軟骨細胞混合植入軟骨缺損部位，能夠支持細胞黏附、存活、增殖和ECM產(chǎn)生[17]。聚乳酸-羥基乙酸支架與MSCs共同植入兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)缺損模型后生成了類似透明軟骨組織[18]。單相高分子支架可促進軟骨細胞的生長，然而其存在降解速率較慢，缺乏適宜的生物力學(xué)強度等問題，為解決這一弊端，有學(xué)者通過采用復(fù)合生物材料的策略，依據(jù)其性能互補的特點來賦予新型復(fù)合支架所需更理想的修復(fù)特性。Yao等[19]合成聚乙烯醇、β-磷酸鈣雙相支架。改善了支架的力學(xué)性能，能夠促進軟骨細胞黏附、增殖，誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化，具有良好的骨軟骨修復(fù)潛能。由瓊脂糖水凝膠/復(fù)合聚乳酸-羥基乙酸/生物活性玻璃材料復(fù)合組成的支架優(yōu)化了支架的功能，提高了骨軟骨修復(fù)能力[20]。

3 種子細胞

間充質(zhì)干細胞來源廣泛，其在病變部位會產(chǎn)生瘢痕和凋亡的抑制因子，促進血管生成，刺激宿主祖細胞分裂為功能再生組織[21]。

研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞缺乏人的白細胞抗原因此具有出色的抗炎和免疫調(diào)節(jié)能力，能夠促進創(chuàng)面愈合和組織再生[22]。間充質(zhì)干細胞能夠阻止許多炎癥性免疫細胞的增殖和功能，例如其能夠抑制樹突狀細胞、自然殺傷細胞的增殖，抑制細胞因子產(chǎn)生細胞毒性，誘導(dǎo)巨噬細胞從促炎M1分化為抗炎表型M2[23]。特別是間充質(zhì)干細胞恢復(fù)了輔助性T細胞和巨噬細胞類型的平衡：它們間接促進Th1到Th2細胞的轉(zhuǎn)變，加速軟骨和肌肉組織的再生。

除了骨髓來源外，干細胞還廣泛存在于脂肪、臍血、胎盤、羊水中，不同來源的干細胞其分化潛能各不相同[24]。脂肪干細胞其來源廣泛，易于提取，除具有骨骼、肌腱、脂肪分化潛能之外，已經(jīng)被證明具有分化成軟骨細胞的能力。文獻[25]研究顯示，與骨髓間充質(zhì)干細胞相比，脂肪干細胞成軟骨分化潛力較差，然而脂肪干細胞聯(lián)合轉(zhuǎn)化生長因子-β和骨形成蛋白使用則可以大大提高其成軟骨分化能力。

研究發(fā)現(xiàn)，在不同的誘導(dǎo)機制作用下可將間充質(zhì)干細胞定向分化形成肌肉、骨、軟骨組織[26]。隨著種子細胞定向分化的研究和進步，將極大提高軟骨相關(guān)疾病患者的生活質(zhì)量。

4 生長因子

現(xiàn)已證明某些生長因子除了能夠誘導(dǎo)干細胞定向分化外，同時能夠影響工程軟骨的物理特性，預(yù)防關(guān)節(jié)退行性改變的發(fā)生發(fā)展。例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）[26]。通過添加生長因子，如TGF-β、成纖維細胞生長因子2（FGF-2）和血小板衍生生長因子BB（PDGF-BB）等，軟骨細胞增殖明顯增多[27]。生長因子IGF-I和FGF-2聯(lián)合治療能夠增強軟骨生成活性，促進全厚層軟骨的形成[28]。體內(nèi)軟骨細胞生存的微環(huán)境中不僅僅只存在單一的某種生長因子，其內(nèi)成分必定復(fù)雜多樣，近些年的研究發(fā)現(xiàn)生長因子之間能產(chǎn)生協(xié)同刺激作用，有利于加速細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，支持軟骨發(fā)育，增強軟骨損傷愈合能力。研究表明，F(xiàn)GF-2和Wnt3a因子協(xié)同作用能夠促進MSCs增殖并增強其軟骨分化潛能[29]。過表達TGF-b3/BMP-6因子可明顯促進脂肪干細胞軟骨相關(guān)基因Sox-9、ACAN和Col2A1的表達，抑制軟骨肥大化，促進形成類似于關(guān)節(jié)軟骨的帶狀結(jié)構(gòu)新骨骼[30]。目前研究者們正趨向于把關(guān)注點集中到生長因子協(xié)同作用促進軟骨細胞的增殖效應(yīng)及其作用機制進行深層次的闡明。

5 基因治療

通過基因治療進行軟骨缺損修復(fù)的概念源于一種觀點，即特異功能基因在損傷部位的表達可以促進軟骨的再生過程。近期，基因治療在軟骨再生方面取得了明顯的突破進展。研究發(fā)現(xiàn)，干細胞在體外進行基因修飾后直接植入關(guān)節(jié)缺損創(chuàng)面能成功修復(fù)軟骨缺損，其是通過上調(diào)軟骨分化促進基因，以及通過下調(diào)抑制基因來實現(xiàn)的[31]?；蛑委熓峭ㄟ^將特異基因轉(zhuǎn)染靶細胞并上調(diào)其表達量以此提高細胞外基質(zhì)合成加快靶細胞向目的細胞分化而促進組織再生[32]。Madry等[33]將目的基因IL-1RA轉(zhuǎn)染進入大鼠和狗等動物的軟骨缺損創(chuàng)面發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染后能夠抑制動物關(guān)節(jié)軟骨退變。

基因修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損過程中常常需要解決的一個問題是，如何避免關(guān)節(jié)液對注射轉(zhuǎn)染細胞的沖釋。研究人員以不同的細胞支架作為修飾后細胞載體，共同注射進入關(guān)節(jié)腔，當(dāng)支架降解時，細胞包被的載體將會吸附在缺損部位從而解決了這一難題?；蛑委熀椭Ъ懿牧系慕Y(jié)合能夠大大提高轉(zhuǎn)染基因的效率，促進軟骨再生修復(fù)。最近的研究表明，適當(dāng)?shù)膫鬟f載體，基因，靶細胞和支架的結(jié)合能夠有效促進透明軟骨生長[34]。然而，盡管基因治療用于緩解骨關(guān)節(jié)相關(guān)疾病已經(jīng)得到了廣泛的理論驗證，但目前仍然有一些問題是必須解決的，例如基因治療過程中靶細胞的凋亡、疾病的傳播等，此外基因的提取和轉(zhuǎn)染在臨床上的成熟運用仍需進一步的研究。

6 人工關(guān)節(jié)軟骨移植

1994瑞典Peterson科研團隊首次將自體軟骨細胞植入術(shù)用于臨床，修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。該方法是從膝關(guān)節(jié)負荷較小的區(qū)域取材軟骨活組織。分離軟骨細胞進行單層培養(yǎng)，并在2～3周后收集細胞懸浮液并將其注射到軟骨缺損區(qū)域。大量的研究發(fā)現(xiàn)自體軟骨細胞移植后關(guān)節(jié)缺損創(chuàng)面可見透明軟骨修復(fù)，術(shù)后患者疼痛得到極大的緩解[35]。目前自體軟骨細胞移植術(shù)已得到進一步發(fā)展，成為一種成熟的細胞療法并得到廣泛應(yīng)用，為廣大的軟骨缺損患者帶來了福音。然而，經(jīng)過長期臨床實踐后發(fā)現(xiàn)該療法仍然存在一些缺陷，例如供體細胞來源不足、供體局部損傷、軟骨細胞肥大退變以及老年患者療效低等。

為了解決這一系列問題，有學(xué)者通過合成材料仿造天然軟骨，設(shè)計了具有類似關(guān)節(jié)軟骨的三維組織結(jié)構(gòu)。Levingstone及其研究團隊通過組織工程方法成功制備三維軟骨支架，支架表面采用Ⅱ型膠原和透明質(zhì)酸制備;中間層由羥基磷灰石組成;而軟骨下骨層包含Ⅰ型膠原和羥基磷灰石混合物[36]。該人工關(guān)節(jié)軟骨具有較好的孔隙率，其性質(zhì)與天然軟組織相似具有良好的軟骨修復(fù)效果。

7 展望

組織工程技術(shù)在修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損方面具有巨大潛能，因此近年來受到廣泛關(guān)注。雖然其在修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損方面進步巨大，但在實踐應(yīng)用過程中仍有一些問題需要解決。目前仍然需要開發(fā)一種新的生物材料，其應(yīng)具有良好的生物活性并且能夠增強材料與細胞之間的相互作用。此外仍需特別關(guān)注移植細胞的存活以及與宿主組織的整合問題。幸運的是：充質(zhì)干細胞、刺激因子和細胞支架的聯(lián)合精確使用可能為解決這些挑戰(zhàn)提供了新的途徑。最后，最嚴峻的挑戰(zhàn)是如何將成功的動物實驗研究成果服務(wù)于臨床。如今，有各種各樣的軟骨組織工程產(chǎn)品，但只有少數(shù)能夠用于臨床試驗，其可能原因包括產(chǎn)品的質(zhì)量控制、穩(wěn)定性、成本、安全性和專利問題。

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（收稿日期：2019-11-25） （本文編輯：張爽）