薛玉涵 任助 商雨 唐國毅 賈妙妙 魯岳峰 李瓊瓊 李慧敏 羅青平 溫國元 潘茲書 趙宗正

摘要：對2017年從雞病料中分離到的2株H7N9亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）A/chicken/Hubei/093/2017（H7N9）和A/chicken/Hubei/207/2017（H7N9）（CK93和CK207）進行了全基因組測序。對血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）序列保守性、HA糖基化位點、NA耐藥位點和6個內(nèi)部基因的關(guān)鍵氨基酸位點進行了分析，同時測定了2株毒株的受體結(jié)合能力。結(jié)果顯示，CK93毒株HA裂解位點為PEIPKGR↓GLF，為低致病性AIV特征;而CK207毒株裂解位點為PKPKRTAR↓GLF，為高致病性AIV特征。HA第226位氨基酸在CK93毒株為亮氨酸（226L），而在CK207毒株為谷氨酰胺（226Q）。但受體結(jié)合能力測定發(fā)現(xiàn)，CK93和CK207都具有結(jié)合α-2，3唾液酸受體和α-2，6唾液酸受體的特性，說明Q226L并非影響病毒受體結(jié)合特性的決定性因素。本研究結(jié)果提示應加強對H7N9亞型禽流感病毒變異監(jiān)測預防其突變可能造成流行的風險。

關(guān)鍵詞：H7N9亞型禽流感病毒;分子特征分析;受體結(jié)合特性

中圖分類號：S852.65?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）07-0212-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.044

Abstract： Two H7N9 subtype avian influenza viruses （AIV） isolated from chicken pathological material in Hubei Province，A/chicken/Hubei/093/2017（H7N9） and A/chicken/Hubei/207/2017（H7N9） （with CK93 and CK207 as their abbreviation，respectively） were analyzed for whole-genome sequencing. The hemagglutinin （HA） and neuraminidase （NA） sequence conservation，as well as HA glycosylation site，NA resistance site and key amino acid sites of 6 internal gene-encoded proteins were analyzed，meanwhile，the receptor binding ability of the two strains was determined as well. The results suggested that the HA protein cleavage site of CK93 was PEIPKGR↓GLF，which indicated a low pathogenicity of CK93，whereas CK207 was mutated to PKPKRTAR↓GLF，which indicated a high pathogenicity of CK207. At the same time，the 226 amino acid sequence of HA in CK93 was Leucine （226L），while its counterpart in CK207 was Glutamine （226Q）. However，the receptor binding ability results suggested that two isolates can be bound to both α-2，3 sialic acid receptor and α-2，6 sialic acid receptor，it is indicated that the Q226L is not a decisive factor affecting receptor binding characteristics. In light of the above information，it is suggested that precaution and control to the mutation of H7N9 subtype avian influenza should be enhanced in order to lower any risk of epidemic owing to its mutation.

Key words： H7N9 subtype avian influenza virus; molecular characterization analysis; receptor-binding specificities

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）為正黏病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒屬成員。病毒的基因組由8個單股負鏈的RNA片段組成，每個片段編碼1種或2種蛋白質(zhì)[1]，編碼的蛋白主要包括3個聚合酶亞單位（PB2、PB1和PA），PB1-F2，PA-X，血凝素蛋白（HA），神經(jīng)氨酸酶（NA），核蛋白（Nucleoprotein，NP），基質(zhì)蛋白（Matrix proteins，M1）和離子通道蛋白M2，非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（Nonstructural proteins，NS）NS1和NEP（NS2）?；诓《?種表面糖蛋白HA和NA的抗原差異，將A型流感病毒分為17個HA亞型（H1～H17）和10個NA亞型（N1～ N10）[2]。由于已知的所有HA和NA亞型均可在野鳥中分離到，目前普遍認為野鳥是 AIVs的天然宿主[3]。病毒主要通過點突變和基因重組的方式發(fā)生變異，導致抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換。

依據(jù)在雞中致病性強弱，禽流感病毒分為高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic AIV，HPAIV）和低致病性禽流感病毒（Low pathogenic AIV，LPAIV）[4]。高致病性禽流感是由部分H5和H7亞型HPAIV引起[5]。中國于2013年首次發(fā)現(xiàn)的H7N9亞型禽流感病毒屬于LPAIV，對家禽及野鳥屬于隱性感染，致病性低，但人感染后會造成重癥肺炎及多器官衰竭，甚至死亡[6]。據(jù)WHO報道，截至2018年9月，已有1 567例人感染H7N9確診病例，病死率接近40%[7]。有研究表明，H7N9病毒具備結(jié)合人類呼吸道受體特性，也保留了結(jié)合禽類呼吸道受體能力，因此能在人和禽類之間傳播[8]。在雪貂模型上證實，H7N9毒株能通過呼吸道進行飛沫傳播[8，9]。但流行病學還未發(fā)現(xiàn)H7N9病毒有人傳人的直接證據(jù)。2017年在廣東發(fā)現(xiàn)了雞高致病性H7N9變異株[10]。H7N9亞型AIV因變異產(chǎn)生高致病性流行株，不僅給中國禽類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大危害，也威脅著人類健康。本研究分離鑒定了1株高致病性和1株低致病性雞源H7N9亞型禽流感病毒，并對其進行了全基因組測序分析和受體結(jié)合能力測定。

1?材料與方法

1.1?材料

SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司;AIV反轉(zhuǎn)錄通用引物Unit12（5-AGCR AAAGCAGG-3）、AIV片段擴增通用引物M-229（上游引物：5-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3;下游引物：5-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3）由生工生物工程（上海）股份有限公司武漢分公司合成;RNA提取試劑TRIzol（Invitrogen）、HiScript反轉(zhuǎn)錄酶（Vazyme）、2×Phanta Max Master Mix高保真酶（Vazyme）、α-2，3-Sialidase（TaKaRa）、唾液酸酶VCNA（Roche）、無菌脫纖維綿羊血購自廣州蕊特生物科技有限公司。

1.2?病毒的分離鑒定與基因組擴增

病毒分離自送檢雞的病料。經(jīng)PCR檢測和序列測定確定為H7N9亞型禽流感病毒，通過除菌過濾、SPF雞胚增殖獲得病毒，并保存于-80℃。病毒實驗在生物安全三級實驗室完成。

用TRIzol試劑從擴增病毒的雞胚尿囊液中提取H7N9病毒RNA，溶解于20 μL的TE緩沖液中。以病毒RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄引物為Unit12，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。取病毒cDNA為模板，用流感通用引物擴增8個基因片段，由生工生物工程（上海）股份有限公司武漢分公司測定基因序列。

1.3?H7N9流感病毒基因序列分析

將HA、NA、PA、PB1、PB2、NS、NP和M基因序列分別登錄美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）進行核苷酸序列Blast分析。從NCBI流感病毒庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/nph-select.cgi#mainform）下載H7N9流感病毒HA、NA基因序列及其編碼蛋白序列。采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis 7.0（MEGA 7.0）軟件進行序列比對，采用鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建H7N9病毒基因進化樹（Bootstrap重復值為1000）。利用序列比對軟件BioEdit中的ClustalW程序進行毒株核苷酸與氨基酸同源性計算。

1.4?紅細胞的配制與受體結(jié)合試驗

雞血采集自健康的SPF公雞，加入10倍體積PBS洗滌，2 000 rpm離心5 min，重復洗滌3次，收集雞紅細胞沉淀;

取雞紅細胞（chicken red blood cells，cRBCs）和綿羊紅細胞（sheep red blood cells，sRBCs）用PBS配成10%的懸液，用PBS洗滌2次，1 500 rpm離心5 min。分別配置如下4種紅細胞懸液：a.用PBS配制1% cRBC懸液，4 ℃下儲存?zhèn)溆?b.用PBS配制1% sRBC懸液，4 ℃下儲存?zhèn)溆?c.取10%的cRBC懸液90 μL，加入10 μL的α-2，3-Sialidase（50 mU/μL），在37 ℃處理10 min，用PBS配制1% 的懸液，4℃下儲存?zhèn)溆?d.取10%的cRBC懸液90 μL，加入10 μL的VCNA（50 mU/μL），在37 ℃處理1 h，用PBS配制1% 的懸液，4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

將50 μL病毒液在96孔V型板（血凝板）中用PBS進行2倍梯度稀釋至2-11，以50 μL PBS為空白對照。每一行分別加入a、b、c、d四種1%RBC懸浮液50 μL，混合，37 ℃孵育20 min后，觀察紅細胞凝聚情況，讀取HA滴度，統(tǒng)計HA效價差異，分析受體結(jié)合能力。

2?結(jié)果與分析

2.1?禽流感病毒的分離鑒定與序列分析

采用RT-PCR方法擴增獲得了2株禽流感病毒全基因組片段（圖1），測序得到2個毒株的全基因組序列。將序列在NCBI上進行Blast分析，確定分離毒株為H7N9亞型禽流感病毒，2株分離株的內(nèi)部基因來自H9N2亞型AIV。將分離到的2個株病毒分別命名為：A/chicken/Hubei/093/2017（H7N9），縮寫為CK93;A/chicken/Hubei/207/2017（H7N9），縮寫為CK207。2株分離株8個基因的全長RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳分析如圖1所示。

2.2?HA與NA基因的遺傳進化及同源性分析

自2014年以來，中國報道的H7N9亞型禽流感病毒主要分為2個進化分支，長江三角洲譜系和珠江三角洲譜系[11]。HA和NA基因序列遺傳進化樹如圖2和圖3所示，結(jié)果顯示①同一地區(qū)的毒株之間進化關(guān)系較近;②同一時間暴發(fā)的病毒之間進化關(guān)系較近，例如2013年暴發(fā)在上海和安徽的毒株同源性較高，2017年暴發(fā)在黑龍江和江蘇的毒株同源性較高;③與CK93的HA基因同源性最高的是人源毒株A/Suzhou/59/2016（H7N9），同源性為99.88%;CK207的HA與禽源毒株A/Chicken/Guangxi/GX102/ 2017（H7N9）的HA同源性為99.71%;④與CK93的NA基因同源性最高的是人源毒株A/inner Mongolia/Tongliao29169/2017，同源性為99.79%;與CK207最接近的是A/Guangdong/S11523/2017（H7N9），同源性為99.28%;⑤CK93和CK207的HA核酸序列同源性在96.33%，氨基酸序列同源性為96.63%;NA核酸序列同源性在99.3%，氨基酸序列同源性為96.99%;⑥CK93和CK207均起源于歐亞地區(qū)，但CK93在中國的進化分支中屬于長江三角洲譜系，CK207可能來源于珠江三角洲譜系。

2.3?HA、NA基因的糖基化位點分析

利用糖基化位點預測服務(wù)器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）對HA和NA氨基酸糖基化位點進行了預測。HA有5個潛在糖基化位點（表1），分別為46NAT48、249NDT251、421NWT423、493NNT495。對比發(fā)現(xiàn)，CK207株與其他研究報道的H7N9毒株相比，糖基化位點并未發(fā)生改變，而CK93株的HA缺失糖基化位點30NGT32。HA的糖基化位點的缺失與病毒傳播效率及致病性的差異密切相關(guān)[12]，CK93病毒HA糖基化位點的改變是否對其傳播有影響值得關(guān)注。NA的糖基化位點有7個，為42 NCT44、52 NTS54、63 NET65、66 NIT68、87?NLT89、142?MGT144、187?NAS189，CK93和CK207 2株NA的糖基化位點與早期報道的H7N9毒株相同。

2.4?高致病性與低致病性H7N9亞型禽流感病毒關(guān)鍵氨基酸位點分析

對2株病毒的HA裂解位點分析比對結(jié)果（表2）顯示，CK93的裂解位點為PEIPKGR↓GLF，含1個堿性氨基酸精氨酸（R），為低致病性禽流感病毒的位點特征;CK207的裂解位點為PKRKRAR↓GLF，含有5個堿性氨基酸，其中4個（KRKR）是連續(xù)的，為高致病性裂解位點。2株病毒均發(fā)生了D186V（H3 numbering）;CK93的226位突變?yōu)榱涟彼幔↙），而CK207為226谷氨酰胺（Q）。2毒株與毒力相關(guān)的HA位點第225位氨基酸均由天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔―225G），有研究表明此位點突變與禽流感病毒毒力增強有關(guān)[13]。

文獻報道結(jié)果顯示，N9亞型NA的酶活性位點可能與119R、120E、122Y、135L、147D、152R、180W、220N、226R、229E、245D、276H、278E、279E、294R、332D、351K和427E密切相關(guān)[14]，分析發(fā)現(xiàn)2毒株NA蛋白酶活性位點均未發(fā)生改變。NA蛋白N端第135～152位氨基酸很有可能是抗原決定簇位點所在，分別為135T、136I、137R、138G、138K、140H、141S、142N、143G、145I、146H、147D、148R、149S、150Q、151Y和152R[15]，2個分離株的這些位點與已報道的H7N9毒株并無差別。但2個分離株NA在屬于莖區(qū)（Stack：36-90位）的69-73位缺失5個氨基酸QISNT（表2）。

2.5?病毒的受體結(jié)合分析

通過HA血凝特性測定了2株H7N9病毒（CK93和CK207）的受體結(jié)合特異性。雞紅細胞（cRBCs）的表面含有α-2，3-連接和α-2，6-連接的唾液酸受體。用α-2，3-唾液酸酶處理的cRBC僅含有α-2，6-連接的唾液酸受體，用霍亂弧菌神經(jīng)氨酸酶（VCNA）處理的cRBC不含受體，而綿羊紅細胞（sRBCs）的表面僅含有α-2，3-連接的唾液酸受體。受體結(jié)合特異性測定結(jié)果顯示，2株H7N9病毒都可以凝集未處理的cRBC和sRBC，對α-2，3唾液酸酶處理過的cRBC表現(xiàn)出良好的親和性，但不能凝集VCNA處理的cRBC。圖4結(jié)果表明，兩株H7N9病毒都保持了既對禽類（α-2，3）受體的親和力，又具有與人類（α-2，6）受體結(jié)合的特性。

3?小結(jié)與討論

H7N9亞型禽流感病毒是禽源性的三源重組病毒，含有家鴨來源的HA基因、野生鳥類NA基因和家禽H9N2內(nèi)部基因[16]。在流行過程中，H7N9存在不同亞型病毒間進行基因片段重組的可能，導致新流行株的產(chǎn)生。人感染新型H7N9禽流感病毒以重癥病例為主，表明該H7N9病毒與其他H7亞型相比對人有更強致病力[17]。因此，加強對H7N9禽流感病毒的病原學監(jiān)測和生物學特性研究，跟蹤了解病毒的變異及進化趨勢，對于制定H7N9禽流感的有效防控策略有重要意義。

本研究的2株H7N9亞型禽流感病毒湖北地方分離株CK93和CK207均起源于歐亞地區(qū)，在中國進化分支中屬于長江三角洲譜系，6個內(nèi)部基因起源于H9N2。但CK93跟人源毒株同源性更高，而CK207跟禽源毒株同源性更高，說明這2個毒株來自不同的進化分支，CK93的HA可能來源于人，CK207則來源于禽類。

有研究表明，H5N1亞型禽流感病毒HA糖基化位點的缺失曾導致病毒傳染性的改變，導致人感染高致病性禽流感[18]。因此，CK93株HA基因糖基化位點存在缺失可能影響其致病性與毒力。HA 蛋白的裂解位點是決定禽流感病毒致病性的關(guān)鍵性因素之一。CK93的裂解位點為H7N9亞型AIV普遍的低致病性裂解位點PEIPKGR↓GLF，而CK207的裂解位點處插入了4個堿性氨基酸（KRKR），突變?yōu)镻KRKRAR↓GLF，為高致病性裂解位點。毒力相關(guān)位點225也由天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔―225G），也可能導致病毒毒力增強。NA莖區(qū)69-73缺失5個氨基酸（QISNT），也是毒力增強的分子標志。研究表明，NA莖區(qū)的氨基酸缺失與從水鳥傳播到陸地家禽的AIV有關(guān)，該缺失使病毒在家禽中更穩(wěn)定，可能增強病毒的復制能力[19]。

目前已確診的人感染H7N9禽流感病例中80%以上有禽或禽類相關(guān)環(huán)境（活禽市場）暴露史，傳播途徑主要是由禽感染人。禽流感病毒要突破種間屏障感染人，必須發(fā)生受體結(jié)合偏好性改變，這種偏好性取決于病毒HA受體結(jié)合位點（Receptor binding site，RBS）的關(guān)鍵氨基酸。受體結(jié)合位點有130環(huán)（131-138）、140環(huán)（140-145）、220環(huán)（219-228）、190螺旋（190-196）以及部分150環(huán)（156-160），RBS區(qū)域關(guān)鍵位點氨基酸的改變會導致病毒受體結(jié)合特性的轉(zhuǎn)換。有研究表明，人源H7N9病毒與α-2，6唾液酸受體結(jié)合特性可能與引入了2個疏水殘基的Q226L和G186V突變有關(guān)。將HAs中220環(huán)與130環(huán)之間的間隔擴大了1 ？，改變了其空間構(gòu)象，提高了病毒對人源受體的親和力[20]，從而增強了病毒對人的感染能力。本研究的2株H7N9毒株均發(fā)生了G186V突變，CK93發(fā)生了Q226L，而CK207仍保留了大部分H7N9毒株普遍的HA-226Q，但是2個毒株均可以結(jié)合人源α-2，6唾液酸受體，表明本研究中的H7N9病毒獲得的人源α-2，6唾液酸受體結(jié)合能力，不只是由HA基因226位氨基酸決定的。用DNAMAN軟件得知，2株分離株的HA氨基酸序列除了裂解位點與第226位氨基酸發(fā)生了突變，還有13處氨基酸位點存在差異，可能會對病毒受體結(jié)合能力產(chǎn)生影響。關(guān)于病毒受體特異結(jié)合的影響因素，將設(shè)計試驗進行進一步的研究。

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