章霞，徐志進，柳敏海，李偉業(yè)，殷小龍

(浙江省舟山市水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316000)

近年來，中國工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖發(fā)展迅猛，其中，生物濾料是循環(huán)水水處理設(shè)施的重要組成部分[1-2]。生物濾料按形態(tài)分可分為顆粒濾料和纖維濾料[3]；按材質(zhì)可分為天然生物濾料、有機高分子濾料、無機濾料和納米材料等[4-5]；按密度可分為浮性濾料、沉性濾料和懸浮性濾料等[6-7]。濾料性質(zhì)是影響生物掛膜、水處理效果和系統(tǒng)微生物多樣性的重要原因。研究表明，高通量測序技術(shù)的發(fā)展可更深入分析濾料系統(tǒng)對微生物的多樣性影響[8-9]。張海耿等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在濾器正常運行時，上層區(qū)域的優(yōu)勢細(xì)菌主要有厭氧繩菌科、硝化螺旋菌屬、暖繩菌科、黃桿菌科和紅桿菌科，底層區(qū)域的優(yōu)勢細(xì)菌主要有微絲菌屬、硝化螺旋菌屬、Defluviimonas屬、Muricauda屬等；陳重軍等[11]研究表明，厭氧氨氧化反應(yīng)器中脫氮微生物多樣性較為豐富，變形菌門Proteobacteria占11.66%～20.28%，浮霉菌門Planctomycetes占2.18%～7.94%，硝化螺旋菌門Nitrospirae占0.19%～6.30%，可見各個運行條件下系統(tǒng)中的微生物多樣性存在差異。聚苯乙烯泡沫濾珠(EPS)、聚乙烯環(huán)(PE)具有質(zhì)量輕、比表面積大、吸附能力強、不易破碎的特點[12-13]，電氣石(Tourmaline)具有吸附水中雜質(zhì)、降低COD、調(diào)節(jié)水pH和氧化還原電位的特點[14]。目前，這3種濾料均已應(yīng)用于造紙廠污水、化工廠排放水或水產(chǎn)養(yǎng)殖循環(huán)水等水處理中。本研究中，采用電氣石球、聚乙烯環(huán)、聚苯乙烯泡沫濾珠3種濾料開展了模擬水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水掛膜和水處理效果的研究，并結(jié)合掛膜后水體中微生物多樣性的變化，研究了不同濾料系統(tǒng)中的微生物功能特點，旨在為工廠化水產(chǎn)養(yǎng)殖的水處理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

生物濾料設(shè)聚乙烯環(huán)(PE)、聚苯乙烯泡沫濾珠(EPS)和電氣石球組(T)，每組用PVC桶組裝成各3套簡易的循環(huán)水系統(tǒng)，上部為40 L的濾料桶(直徑25 cm，高81.6 cm)，其中裝有20 L濾料，下部為蓄水桶(直徑100 cm，高70 cm)，盛放水體400 L，通過水泵(流量2600 L/h)實現(xiàn)下進水上出水循環(huán)，其中濾料與水體體積的比為1∶20。濾料圖和水處理裝置如圖1、圖2所示。

圖1 不同濾料Fig.1 Different filter materials used in the experiment

圖2 試驗運行示意圖Fig.2 Operation schematic diagram in the trial

1.2 方法

1.2.2 掛膜濾料電鏡觀察 取掛膜好的濾料進行叔丁醇脫水固定、真空冷凍機干燥，噴金后采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本Hitachi s4800型)觀察PE的側(cè)切面及EPS、電氣石球表面。

1.2.3 掛膜成功后水體和濾料表面微生物多樣性檢測

(1)水中微生物取樣。掛膜成功后，從每個桶各取水樣2 L，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，每組混合為1個樣本，樣本分別記為聚乙烯環(huán)水體(PEw)、泡沫濾珠水體(EPSw)和電氣石球水體(Tw)。

(2)濾料表面微生物取樣。掛膜成功后，從每個桶取約50 mL待檢測生物膜填料，用PBS緩沖液(0.1 mol/L)清洗3遍去除生物膜表面附著雜質(zhì)，再將填料置于50 mL離心管中，加入25 mL PBS緩沖液(0.1 mol/L)和適量550 ℃下灼燒2 h后的細(xì)砂(粒徑<420 μm)，蓋好蓋后將離心管在渦旋振蕩器中旋轉(zhuǎn)振蕩5 min(務(wù)必使細(xì)砂與填料達(dá)到充分接觸的狀態(tài))，此過程中細(xì)砂與填料表面的碰撞與摩擦可以刮下填料細(xì)微結(jié)構(gòu)部分的生物膜，略沉淀，用0.22 μm濾膜過濾并取出填料，每組混合為1個樣本。樣本名稱分別記為聚乙烯環(huán)(PE)、泡沫濾珠(EPS)、電氣石球(T)。

(3)DNA提取及擴增測序分析。采用DNeasy PowerSoil Kit(50) (MoBio)提取DNA，并采用引物進行16S rDNA V4高可變區(qū)的PCR擴增。本試驗中采用帶GC夾細(xì)菌通用引物341 F(5′CCTACGGGAGGCAGCAG 3′)和534 R(5′ ATTACCGCGGCTGCTGG 3′)進行細(xì)菌基因組DNA的擴增，GC-clamp序列為CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGGG，擴增片段為細(xì)菌16S rDNA的V3～V4可變區(qū)。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：10×LAPCR buffer(mg2+plus)5 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，50 ng/μL模板DNA 2.0 μL，滅菌去離子水36.5 μL。采用降落PCR模式 touchdown-PCR，反應(yīng)程序為：94 ℃下預(yù)變性5 min，94 ℃下循環(huán)變性30 s，65 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸90 s，每個退火溫度降0.5 ℃，共進行20個循環(huán)，在此退火溫度下再進行15個循環(huán)，最終在72 ℃下延伸5 min，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

(4)測序數(shù)據(jù)。由 Illumina Miseq 測序先獲得原始雙端測序數(shù)據(jù)，再經(jīng)過去雜、拼接、嵌合體序列處理后獲得較為優(yōu)質(zhì)的序列 valid tags，最后進行OTU分類、系統(tǒng)發(fā)育樹、Alpha 及 Beta 多樣性等分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和差異顯著性檢驗，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濾料組的掛膜情況

從圖3可見：在48 d的掛膜過程中，3個濾料組的氨氮濃度呈先升高后降低的趨勢；EPS和PE組在16 d時氨氮濃度開始下降，T組在20 d時氨氮濃度開始下降，3組濾料氨氮濃度下降速率依次為T組>EPS組>PE組，且T組氨氮消除時間比EPS組早4 d，比PE組早8 d。

圖3 3個水處理組中氨氮含量的變化Fig.3 Changes in ammonia-nitrogen concentration in 3 water treatment groups

從圖4可見：在12 d內(nèi)，各組亞硝酸鹽濃度維持穩(wěn)定；在16～24 d內(nèi)，EPS組和PE組的亞硝酸鹽濃度呈逐漸上升的趨勢，在24 d后開始下降；而T組在16～20 d內(nèi)逐漸上升，20 d后開始下降；待亞硝酸鹽濃度下降至最低時，T組所需的時間比EPS組早4 d，比PE組早8 d。

圖4 3個水處理組中亞硝酸鹽含量的變化Fig.4 Changes in nitrite concentration in 3 water treatment groups

2.2 掛膜后濾料的電鏡觀察

在系統(tǒng)運行48 d后，隨機取PE、EPS及T組的生物填料進行電鏡掃描(圖5)，結(jié)果顯示：PE在2萬倍顯微鏡下觀察，表面有球菌和桿菌附著；EPS在3萬倍顯微鏡下觀察，表面有大量球菌；電氣石球在1萬倍顯微鏡下觀察，表面有大量球菌和桿狀細(xì)菌?？梢?，3種材料均實現(xiàn)了生物掛膜。

注：M為球狀細(xì)菌；R為桿狀細(xì)菌Note：M， micrococcus; R， rod-shaped bacteria圖5 3種濾料成熟掛膜后的電鏡圖Fig.5 Electronic microscopic image of 3 kinds of filter materials after mature membrane hanging

2.3 不同濾料組的水處理能力

2.3.1 不同濾料組的氨氮去除能力 從表1可見：3組濾料中氨氮去除率在前6 h略有降低，在6～12 h時，氨氮有所升高，在12 h后，氨氮去除率開始下降；在18 h時EPS組氨氮的去除率顯著高于其他兩組(P<0.05)；T組在30 h時氨氮去除率達(dá)90.80%，PE組在42 h時氨氮去除率達(dá)90.75%，EPS組在54 h時氨氮去除率達(dá)92.23%?？梢?，T組的去除效率高于PE組和EPS組；在54～66 h時，T組、PE組的氨氮去除率顯著高于EPS、T組(P<0.05)，84～96 h時，各組間的氨氮去除率均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 3種濾料不同時間段氨氮的去除率

2.3.2 不同濾料組的亞硝酸鹽去除能力 從表2可見：3組濾料中亞硝酸鹽去除率隨時間延長呈現(xiàn)增長趨勢，并在48 h后趨于平衡；在48 h內(nèi)，T組的亞硝酸鹽去除率高于PE組(除6 h外)，而PE組又高于EPS組；在42 h時，T組的亞硝酸鹽去除率為99.39%，顯著高于PE組和EPS組(P<0.05)；在48～96 h后，T組的亞硝酸鹽去除率高于其他兩組(P>0.05)，且均維持在99.18%以上。

表2 3種濾料不同時間段亞硝酸鹽的去除率

2.4 不同濾料組掛膜成熟后水體和濾料表面微生物多樣性分析

2.4.1 不同濾料組細(xì)菌豐度及多樣性分析 從表3可見：3組循環(huán)系統(tǒng)水體中和濾料表面的微生物原始序列和有效序列差異不大，通過比較3組樣品的Chao指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)發(fā)現(xiàn)，PE組水體中微生物豐富度和群落多樣性均高于其他兩組，EPS組濾料表面的微生物豐富度高于其他兩組，而PE組濾料表面的微生物群落多樣性則高于其他兩組。

表3 3組水循環(huán)系統(tǒng)中細(xì)菌豐度情況Tab.3 Bacterial abundance in 3 groups of water circulation systems

2.4.2 樣本的Alpha多樣性指數(shù)分析和物種間相似性分析 從Rank Abundance曲線可以看出樣品所含物種的豐富程度和均勻程度，曲線在橫軸上的長度越寬表示物種組成越豐富，而在縱軸上跨度越小、曲線越平坦表示物種組成均勻程度越高。從圖6可見，水體中PEw的微生物物種組成相比EPSw和Tw較為豐富和均勻，而濾料EPS表面的微生物物種組成相比PE和T濾料較為豐富和均勻。根據(jù)OTU注釋結(jié)果，繪制3個樣本的微生物物種間相似性的雙層聚類圖(Heatmap)，包括樣本間聚類關(guān)系樹和物種OTU豐度相似性樹。從圖7可以看出，無論水體中還是濾料表面的微生物組成均為EPS組和T組的相似性較高。

圖6 3組濾料運行系統(tǒng)細(xì)菌的豐富程度比較Fig.6 Comparison of the abundance of bacteria in 3 filter medium operation systems

2.4.3 3組濾料運行系統(tǒng)水體細(xì)菌在門、屬分類層面的分布規(guī)律 3組循環(huán)水處理中水體和濾料表面微生物在門分類層面的分布規(guī)律如表4所示，無論水中還是濾料表面，PE組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性較EPS組和T組更為豐富，且豐富度排列前5的細(xì)菌門類大致相同，分別為變形菌門、厚壁菌門、

表4 3組循環(huán)系統(tǒng)水中及濾料表面細(xì)菌(門)的群落組成相對百分比

擬桿菌門、放線菌門、硝化螺旋菌門，各組中細(xì)菌豐富度排列順序和種類略有差異。PEw按照菌類豐富度排列前5的分別為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、硝化螺旋菌門；EPSw中分別為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、TM6、放線菌門；Tw中分別為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、Gracilibacteria、硝化螺旋菌門。其中，水體中EPSw和Tw的變形菌門占比均高于PEw，而厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和硝化螺旋菌門占比相較PEw則少；水體中PEw的微生物中存在厚壁菌門、梭桿菌門、芽單胞菌門和Cloacimonetes，而EPSw、Tw中則未檢測到。濾料中，PE中按照菌類豐富度排列前5的分別為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門；EPS中分別為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門、放線菌門；T中分別為變形菌門、硝化螺旋菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門。其中，PE中厚壁菌門、放線菌門占比較其他兩組高；T中硝化螺旋菌門占比高于EPS和PE；EPS、T中變形菌門遠(yuǎn)高于PE。

注：A為濾料上的微生物；B為水體中的微生物

從表5可見：水體中細(xì)菌豐富度屬類差異也較大，其中，PEw中按照豐富度排列前5的分別為遠(yuǎn)洋桿菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬、油螺旋菌屬、OM43_clade；EPSw中分別為遠(yuǎn)洋桿菌屬、OM43_clade、油螺旋菌屬、NS5_marine_group、醋桿菌屬；Tw中分別為遠(yuǎn)洋桿菌屬、油螺旋菌屬、OM43_clade、中溫黃桿菌屬和貝塔變形菌屬。

表5 3組循環(huán)系統(tǒng)水中細(xì)菌(屬)的群落組成相對百分比

從表6可見：濾料中，PE表面生物膜按照豐富度排列前5的分別為Symbiobacterium、Mobilitalea、尿素芽孢桿菌屬、瘤胃梭菌屬、擬桿菌屬；EPS表面排列前5的分別為貝塔變形菌屬、亞硝化單胞菌屬、硝化螺旋菌屬、Owenweeksia、擬桿菌屬；T表面排列前5的分別為貝塔變形菌屬、亞硝化單胞菌屬、硝化螺旋菌屬、擬桿菌屬、糞桿菌屬。

表6 3組循環(huán)系統(tǒng)濾料表面細(xì)菌(屬)的群落組成相對百分比

3 討論

3.1 不同濾料對掛膜和水處理效果的影響

生物濾池是循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的核心，對其的研究主要包括生物濾料的選擇[15]、培養(yǎng)[16]、運行條件[17-18]及環(huán)境因子[19]等技術(shù)環(huán)節(jié)。本研究中就濾料的選擇進行了研究，結(jié)果表明，在48 d的掛膜期間，電氣石球組氨氮和亞硝酸鹽消除時間比聚苯乙烯泡沫濾珠組早4 d，比聚乙烯環(huán)組早8 d，可見電氣石球的掛膜速率較聚乙烯環(huán)和聚苯乙烯泡沫濾珠快，這可能是因為電氣石球表面的孔隙、孔洞等有利于生物的附著、固定，且對附著物也有屏障保護作用，水力剪切沖刷作用較少，有利于微生物代謝過程中的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳質(zhì)過程。李義菲等[20]研究表明，電氣石能夠提高氮的去除率，且表現(xiàn)出較好的耐負(fù)荷沖擊能力。韓雅紅等[21]研究表明，電氣石顆粒能夠縮短序批式反應(yīng)器(SBR)的啟動時間，并可快速恢復(fù)反硝化菌、硝化菌、PAOs 及 DPAOs代謝能力。

此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，水處理試驗48 h內(nèi)，電氣石球組的氨氮、亞硝酸鹽去除效率高于聚乙烯環(huán)組，而聚乙烯環(huán)組又高于聚苯乙烯泡沫濾珠組，這可能與濾料本身的材質(zhì)特性有關(guān)。Tan等[22]研究表明，添加了電氣石的序批式反應(yīng)器SBR1生物群落相較于未添加電氣石的SBR2更加穩(wěn)定，且隨著氮加載率的升高，SBR1的氨氮去除率和總氮去除率高于SBR2。另有研究表明，電氣石球能調(diào)節(jié)初始pH值為3～10的不同鹽度的海水趨向弱堿性，催化降解有機物，使蒸餾水核磁共振半高幅寬變窄，降低了水分子締合度，具有促進細(xì)菌、細(xì)胞生長和代謝的功能[23-24]。可見，在水處理時間和生物膜穩(wěn)定性上，電氣石的性能均優(yōu)于有機高分子材料(PE、EPS)，這使得電氣石球廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水處理工程將成為可能。

3.2 不同濾料對系統(tǒng)中微生物多樣性的影響

目前，已有眾多學(xué)者圍繞生物濾池中微生物菌群的組成開展了研究[25-26]，旨在了解各個運行條件下的菌群組成及變化規(guī)律。本研究結(jié)果表明，在3組系統(tǒng)中，無論水體還是濾料表面均為聚乙烯環(huán)組微生物群落多樣性高于其他兩組，這說明不同濾料可能因為材質(zhì)、耐沖刷能力、水力特性等性質(zhì)差異造成水環(huán)境中微生物菌群的不一致[27]。而3組系統(tǒng)的水體和濾料表面豐富度排列前5的細(xì)菌門類大致相同，豐富度較高的分別為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和硝化螺旋菌門，這與黃志濤等[9]的研究結(jié)果一致，變形菌門和硝化螺旋菌門均具有重要的脫氮功能。電氣石球組水體中變形桿菌門明顯高于聚乙烯環(huán)組，而濾料中變形桿菌門和硝化螺旋菌門明顯高于聚乙烯環(huán)組和聚苯乙烯泡沫濾珠組，這可能是造成3組系統(tǒng)均具備優(yōu)異水處理能力且電氣石球組水處理效果較其他兩組更佳的原因。另在本研究的水處理效果試驗過程中，3組濾料系統(tǒng)的氨氮去除率在72 h后均能達(dá)到98%以上，亞硝酸鹽的去除率在54 h后均能達(dá)到99%以上，水處理效果皆顯著，且在48 h內(nèi)，電氣石球組的氨氮、亞硝酸鹽去除效率均高于其他兩組。在微生物多樣性分析結(jié)果中，3種濾料表面的亞硝化單胞菌屬和硝化螺旋菌屬占比依次為電氣石>聚苯乙烯泡沫濾珠>聚乙烯，與水處理效果相符，這表明海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水處理中，細(xì)菌Nitrosomonas和Nitrospira起主要的硝化作用[28-29]，而電氣石可降低亞硝酸鹽氧化菌的相對豐度，提高污水系統(tǒng)中氮的去除率[30]。

此外本研究中還發(fā)現(xiàn)，水體中和濾料表面中的優(yōu)勢菌屬在3組中各不相同，聚乙烯環(huán)組水體擬桿菌屬、乳酸桿菌屬、糞便桿菌屬、亞硝化單胞菌屬占比均高于其他兩組，而濾料中聚乙烯環(huán)組貝塔變形菌屬、亞硝化單胞菌屬均未被檢測到，硝化螺旋菌屬也明顯低于聚苯乙烯泡沫濾珠組和電氣石球組，推測聚乙烯環(huán)組水處理優(yōu)勢菌主要集中的水體中，而聚苯乙烯泡沫濾珠組和電氣石球組水處理優(yōu)勢菌主要集中在濾料表面，更深入和科學(xué)的研究還有待繼續(xù)。

4 結(jié)論

(1)不同的濾料對生物掛膜和水處理效果均有顯著的影響。在本試驗中，電氣石球組的掛膜時間短于聚苯乙烯泡沫濾珠組，而聚苯乙烯泡沫濾珠組掛膜時間又短于聚乙烯環(huán)。

(2)在水處理效果試驗中，48 h內(nèi)，氨氮、亞硝酸鹽去除效率依次為電氣石球>聚乙烯環(huán)>聚苯乙烯泡沫濾珠。

(3)微生物多樣性分析顯示，電氣石球組的水體中變形桿菌門明顯高于聚乙烯環(huán)水體，濾料中變形桿菌門和硝化螺旋菌門顯著高于聚乙烯環(huán)和聚苯乙烯泡沫濾珠。

(4)生物濾料的處理效果一般綜合其生物膜的掛膜時間長短、水處理效果及濾料上生物膜生長的優(yōu)劣等指標(biāo)進行評價。由此可見，電氣石球作為濾料的處理效果明顯優(yōu)于聚乙烯環(huán)和聚苯乙烯泡沫濾珠。