雷 磊，趙 鵬，楊昌偉，劉傳明，尹 文，李俊杰

膿毒癥是由于各種病原體微生物和毒素物質(zhì)的侵入引起宿主的不適應(yīng)反應(yīng)，產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和炎性因子，引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)，可致患者休克、器官功能衰竭甚至危及生命[1-2]。膿毒癥一般在機(jī)體受到感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷、再灌注損傷、缺氧以及外科手術(shù)之后被引發(fā)，致死率高達(dá)25%。因其病因復(fù)雜目前尚無(wú)特效治療方法[3]。MicroRNA(miRNA)能直接與下游靶基因結(jié)合、降解mRNA進(jìn)而抑制下游蛋白翻譯[4]。近來(lái)有大量研究表明一些miRNA參與膿毒癥的調(diào)控，如敲除miR-9可減弱脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的膿毒癥對(duì)白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)分泌的誘導(dǎo)作用[5]；TargetScan等軟件預(yù)測(cè)miR-21有很多靶基因，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-beta， TGF-β)是其中之一，其在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)，能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡以及轉(zhuǎn)移[4,6]。而TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子，哺乳動(dòng)物中有3種異構(gòu)體，其中以TGF-β1活性最強(qiáng)，能促進(jìn)蛋白酶抑制劑合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和組織增生[7]，參與膿毒癥的調(diào)控[8-9]。本研究從基因調(diào)控層面來(lái)探索miR-21-5p是否對(duì)TGF-β1具有靶向作用，是否可以通過(guò)靶向TGF-β1來(lái)改善LPS誘導(dǎo)的膿毒癥，并探討這三者之間的關(guān)聯(lián)，從而為膿毒癥的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只C57BL/6小鼠(6～8周，南京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。

1.2藥物與試劑 LPS(Sigma-Aldrich)；miR-21-5p antagomir、miR-21-5p mimic、si-TGF-β1載體(RiboBio)；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒(TaKaRa)；降鈣素檢測(cè)試劑盒(北京熱景生物技術(shù)有限公司)；丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒(Promega)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、蛋白提取試劑盒(康為世紀(jì))；TGF-β1抗體(CST)；羊抗兔二抗(Santa)；PVDF膜(Millipore)。

1.3儀器 多功能酶標(biāo)儀(Labsystem Multiskan)；熒光定量?jī)x(Bio-Rad)。

1.4方法

1.4.1建立LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型：對(duì)小鼠腹腔注射10 mg/kg的LPS，注射5 d，建模劑量和時(shí)間參照文獻(xiàn)[5]。

1.4.2分組和處理：靜脈注射miR-21-5p antagomir以低表達(dá)miR-21-5p，注射si-TGF-β1以低表達(dá)TGF-β1。將小鼠分為對(duì)照組、膿毒癥組、NC antagomir組、siRNA-NC組、miR-21-5p antagomir組、si-TGF-β1組，每組6只。對(duì)照組為健康小鼠；膿毒癥組為L(zhǎng)PS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠；NC antagomir組為注射NC antagomir的LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠；siRNA-NC組為注射siRNA-NC的LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠；miR-21-5p antagomir組為注射miR-21-5p antagomir的LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠；si-TGF-β1組為注射si-TGF-β1的LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠。所有注射均為靜脈注射，每3天注射1次，每次10 nmol/L，最終濃度50 nmol/L。

1.5檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1降鈣素和超敏C反應(yīng)蛋白：取6組小鼠血清，用上轉(zhuǎn)電化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)降鈣素水平，用ELISA試劑盒檢測(cè)超敏C反應(yīng)蛋白水平，方法參照使用說(shuō)明書(shū)。

1.5.2miR-21-5p和TGF-β1水平的檢測(cè):用Trizol試劑盒提取組織總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA以及miRNA合成cDNA，按照2×SYBR Green Master Mix的操作說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR。

1.5.3Western blot檢測(cè)TGF-β1表達(dá)水平：提取總蛋白并測(cè)定其濃度，取30 μg于SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用脫脂乳密封1 h，加入TGF-β1抗體4℃過(guò)夜孵育，洗膜后用二抗孵育1 h，用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)。

1.5.4miR-21-5p與TGF-β1靶向關(guān)系的驗(yàn)證：用PCR擴(kuò)增軟件預(yù)測(cè)的位于TGF-β1 3'UTR區(qū)與miR-21-5p的結(jié)合位點(diǎn)附近的200 bp序列(TGF-β1-wt，野生型)，設(shè)計(jì)突變體(TGF-β1-mut，在結(jié)合位點(diǎn)處設(shè)計(jì)突變)，分別連入雙熒光素酶報(bào)告載體。將其與NC-mimic和miR-21-5p mimic載體按不同組合分別共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在多功能酶標(biāo)儀上按雙熒光素報(bào)告分析試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)TGF-β1 3'UTR熒光素酶的活性。

1.5.5炎性因子：取6組小鼠血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6、TNF-α的水平，具體方法參照使用說(shuō)明書(shū)。

1.5.6氧化應(yīng)激反應(yīng)活性：用分光光度法檢測(cè)SOD、MDA的活性，具體方法參照使用說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果

2.1成功構(gòu)建小鼠模型 膿毒癥組降鈣素和超敏C反應(yīng)蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)圖1A和1B。表明用LPS誘導(dǎo)制備的膿毒癥小鼠模型是成功的。對(duì)不同處理下的小鼠血清中miR-21-5p和TGF-β1的表達(dá)水平定量分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，膿毒癥組小鼠miR-21-5p表達(dá)明顯下調(diào)，TGF-β1明顯上調(diào)(P<0.05)；miR-21-5p antagomir組血清中miR-21-5p的表達(dá)量低于NC antagomir組和對(duì)照組，si-TGF-β1組血清中TGF-β1的表達(dá)量顯著低于siRNA-NC組和對(duì)照組(P<0.05，P<0.01);NC antagomir組miR-21-5p mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組,siRNA-NC組TGF-β1 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖1C和1D。表明這2種小鼠都瞬轉(zhuǎn)成功。

圖1 成功構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠降鈣素、超敏C反應(yīng)蛋白和miR-21-5p、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平

2.2miR-21-5p與TGF-β1之間存在靶向關(guān)系 首先用TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-21-5p與TGF-β1的靶向關(guān)系，在TGF-β1的3'UTR區(qū)425-432 bp區(qū)域發(fā)現(xiàn)了2個(gè)hsa-miR-21-5p潛在的靶向結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖2A。接著用NC antagomir、miR-21-5p antagomir(低表達(dá)miR-21-5p)、NC mimic、miR-21-5p mimic(高表達(dá)miR-21-5p)、siRNA-NC、si-TGF-β1(敲除TGF-β1)分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并檢測(cè)miR-21-5p和TGF-β1表達(dá)水平的變化。轉(zhuǎn)染miR-21-5p antagomir會(huì)顯著降低miR-21-5p的表達(dá)水平(P<0.05)，見(jiàn)圖2B；而轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimic會(huì)顯著提升miR-21-5p的表達(dá)水平(P<0.01)，見(jiàn)圖2C；轉(zhuǎn)染si-TGF-β1會(huì)顯著降低TGF-β1的表達(dá)水平(P<0.01)，見(jiàn)圖2D。說(shuō)明細(xì)胞轉(zhuǎn)染是成功的。從圖2E來(lái)看，相對(duì)于對(duì)照組和轉(zhuǎn)染si-TGF-β1組，轉(zhuǎn)染miR-21-5p antagomir后TGF-β1的表達(dá)水平顯著提升(P<0.05)，提示抑制miR-21-5p的表達(dá)可以提高TGF-β1的表達(dá)，即miR-21-5p對(duì)TGF-β1有負(fù)調(diào)控的作用。最后用雙熒光素報(bào)告分析進(jìn)一步驗(yàn)證miR-21-5p與TGF-β1的靶向關(guān)系，在預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)處設(shè)計(jì)突變體(TGF-β1-mut)，發(fā)現(xiàn)野生型(TGF-β1-wt)能使熒光素酶的活性顯著下降(P<0.05)，而突變體并無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖2F。提示miR-21-5p靶向并負(fù)調(diào)控TGF-β1的表達(dá)。

圖2 膿毒癥小鼠miR-21-5p與TGF-β1之間的靶向關(guān)系

2.3miR-21-5p通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥炎癥 膿毒癥組小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明膿毒癥時(shí)炎癥非常嚴(yán)重。相對(duì)于膿毒癥組，miR-21-5p antagomir組小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平顯著升高，而si-TGF-β1組顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖3。提示抑制TGF-β1的表達(dá)使得炎癥減輕，而抑制miR-21-5p的表達(dá)會(huì)使TGF-β1的表達(dá)升高，從而炎癥加重，即miR-21-5p靶向抑制TGF-β1的表達(dá)減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥炎癥。

圖3 miR-21-5p靶向抑制TGF-β1的表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥炎性因子水平的影響

2.4miR-21-5p通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥的氧化應(yīng)激反應(yīng) 與對(duì)照組比較，膿毒癥組小鼠血清中SOD活性顯著下降，MDA活性顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明膿毒癥時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇。與膿毒癥組比較，miR-21-5p antagomir組小鼠血清中SOD活性顯著下降，MDA活性顯著升高，而si-TGF-β1組SOD活性顯著升高，MDA活性顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。提示抑制TGF-β1的表達(dá)可減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，而抑制miR-21-5p的表達(dá)會(huì)使TGF-β1的表達(dá)升高，從而加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，即miR-21-5p通過(guò)靶向抑制TGF-β1的表達(dá)來(lái)減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖4 miR-21-5p靶向抑制TGF-β1的表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥的氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

2.5miR-21-5p通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)改善LPS誘導(dǎo)的膿毒癥 與對(duì)照組比較，膿毒癥組降鈣素和超敏C反應(yīng)蛋白水平升高(P<0.05，P<0.01)；與膿毒癥組比較，miR-21-5p antagomir組小鼠血清中降鈣素、超敏C反應(yīng)蛋白的水平顯著提高，si-TGF-β1組顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖5。提示抑制TGF-β1的表達(dá)會(huì)降低降鈣素、超敏C反應(yīng)蛋白的表達(dá)水平，而抑制miR-21-5p的表達(dá)可提高TGF-β1的表達(dá)水平，進(jìn)而使降鈣素、超敏C反應(yīng)蛋白的表達(dá)水平升高，加劇膿毒癥。

圖5 miR-21-5p靶向抑制TGF-β1表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥降鈣素和超敏C反應(yīng)蛋白水平的影響

3 討論

膿毒癥是嚴(yán)重感染患者死亡的主要原因，危害嚴(yán)重，且目前尚無(wú)有效治療方法。因此本研究將從miRNA入手來(lái)探索其發(fā)病機(jī)制，期望為膿毒癥的治療打開(kāi)一個(gè)新的窗口。miRNA廣泛存在于人體液中，且具有獨(dú)特的選擇性和穩(wěn)定性，因此被視為臨床診斷的理想生物標(biāo)志物。每個(gè)miRNA都有多個(gè)靶基因，一般是通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)，且具有高度的保守性，進(jìn)而調(diào)控多種細(xì)胞功能和病理過(guò)程，而且在其中扮演的角色和功能也各有不同[6]。miR-21-5p在多種疾病中高表達(dá)，如乳腺癌[10]、前列腺癌、喉癌等[4]和急性腎損傷[6]，miR-21可促進(jìn)人成骨細(xì)胞分化[11]。通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其有很多靶基因，如LCRG1、PDCD4、TGF-β、BMPR2等[4,6,10,12]。TGF-β屬于TGF-β超家族，是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，廣泛存在于各個(gè)組織和器官中，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[13]。TGF-β1是TGF-β表達(dá)的異構(gòu)體中活性最強(qiáng)的，研究報(bào)道最多，其可以調(diào)控細(xì)胞分化及組織增生，進(jìn)而參與各類疾病調(diào)控[7,14-15]。早有研究表明，TGF-β1參與膿毒癥的調(diào)控，如姜黃素可以通過(guò)抑制TGF-β1/SMAD3通路的表達(dá)對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷起保護(hù)作用[8]。外源細(xì)胞色素C可通過(guò)下調(diào)TGF-β1的表達(dá)來(lái)改善膿毒癥誘導(dǎo)的心肌功能障礙[9]。但目前還未見(jiàn)有相關(guān)研究詳細(xì)報(bào)道m(xù)iR-21-5p與TGF-β1是否真實(shí)存在靶向關(guān)系，以及這種關(guān)系在膿毒癥調(diào)控中扮演的角色。

降鈣素和超敏C反應(yīng)蛋白是膿毒癥診斷和治療的生物標(biāo)志物[3,16-17]，具有較高的準(zhǔn)確性和特異性，表達(dá)水平過(guò)高，表明膿毒癥較嚴(yán)重[18]。本研究結(jié)果顯示，構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠體內(nèi)降鈣素和超敏C反應(yīng)蛋白的水平顯著高于對(duì)照組。提示膿毒癥小鼠模型構(gòu)建是成功的。通過(guò)定量檢測(cè)膿毒癥小鼠體內(nèi)miR-21-5p和TGF-β1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-21-5p在膿毒癥中低表達(dá)，而TGF-β1高表達(dá)，結(jié)果與以往研究一致[9]。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在TGF-β1的3'UTR區(qū)425-432 bp區(qū)域有2個(gè)hsa-miR-21-5p潛在的靶向結(jié)合位點(diǎn)。在轉(zhuǎn)染miR-21-5p antagomir的293T細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)量高于對(duì)照組，表明抑制miR-21-5p的表達(dá)可以促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)，呈負(fù)相關(guān)。本研究雙熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果，TGF-β1-wt能使熒光素酶的活性顯著下降，這就證實(shí)了靶向結(jié)合位點(diǎn)的存在，miR-21-5p可以靶向抑制TGF-β1的表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，miR-21-5p antagomir組小鼠血清中IL-6、TNF-α、MDA、降鈣素和超敏C反應(yīng)蛋白的水平都顯著高于膿毒癥組，SOD水平低于膿毒癥組，而si-TGF-β1組卻是相反的結(jié)果，提示抑制TGF-β1的表達(dá)可減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及膿毒癥癥狀，而抑制miR-21-5p的表達(dá)會(huì)使TGF-β1的表達(dá)升高，進(jìn)而使各項(xiàng)癥狀加重。

綜上所述，miR-21-5p通過(guò)靶向抑制TGF-β1的表達(dá)可以減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥引起的炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而改善膿毒癥?；诒狙芯拷Y(jié)果，或許可以通過(guò)藥物調(diào)控miR-21-5p的表達(dá)，進(jìn)而改善膿毒癥，為膿毒癥的治療找到了一個(gè)新的突破口。