不同病理類型食管癌GRP78、GRP94表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系分析

彭 蓉，娜吧錯，益西卓呷，呂婷婷

食管癌為消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，好發(fā)于食管黏膜上皮及腺體，全球每年約有30萬人死于食管癌，我國為食管癌高發(fā)地區(qū)之一，90%以上為鱗狀細(xì)胞癌，以進(jìn)行性吞咽困難、胸骨后疼痛等為主要癥狀，病因多與人群分布、飲食習(xí)慣及遺傳易感性等緊密相關(guān)[1]。因早期食管癌患者缺乏典型臨床癥狀，大多數(shù)確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)食管癌患者臨床治療效果差且生存率低，研究指出單純參照食管癌患者TNM分期并不能準(zhǔn)確地判斷預(yù)后，而盡早準(zhǔn)確判斷食管癌預(yù)后對降低其病死率有一定積極作用[2]。隨著分子生物學(xué)快速發(fā)展，越來越多研究證實(shí)腫瘤標(biāo)志物與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后有關(guān)[3-4]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose regulatory protein， GRPs)為一種應(yīng)激蛋白，在低糖及缺氧情況下其合成量明顯升高，可協(xié)助蛋白質(zhì)折疊、運(yùn)輸以及裝配，有學(xué)者研究證實(shí)GRP78、GRP94與人類腫瘤有關(guān)[5]；國內(nèi)對不同病理類型食管癌GRP78表達(dá)及其與預(yù)后關(guān)系尚未完全明確，本研究采用免疫組化法檢測GRP78、GRP94在不同病理類型食管癌中的表達(dá)情況，通過分析GRP78、GRP94與食管癌患者病理參數(shù)及其預(yù)后的關(guān)系，以期為食管癌患者的早期診治提供有用參考信息。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2010年1月—2014年1月在我院外科手術(shù)治療的78例食管癌石蠟包埋癌組織和30例癌旁石蠟包埋組織(癌旁組織距癌組織5 cm以上)。標(biāo)本來源病例的一般資料：男42例，女36例，年齡21～68(45.12±3.16)歲；臨床分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期21例，Ⅲ期33例；病理類型：腺癌22例，鱗癌56例；分化程度：低分化34例，中分化24例，高分化20例。所有標(biāo)本均經(jīng)本院病理科進(jìn)一步檢驗(yàn)，本研究征得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意，獲得患者知情同意，且均獲得有效隨訪。

1.2方法

1.2.1免疫組化法染色：組織切片脫蠟水化-消除內(nèi)源性過氧化物酶活性-抗原修復(fù)-滴加一抗-滴加二抗-DAB顯色-染色-脫水、透明-封片；GRP78、GRP94陽性結(jié)果判定：細(xì)胞著色于細(xì)胞漿，呈棕黃色[6]，采用半定量積分法判定染色強(qiáng)度，每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，取其平均值，陽性細(xì)胞所占比例≤5%記為0分，6%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，>75%記為4分；陽性細(xì)胞表達(dá)著色深度：不著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色各記為0、1、2、3分，兩項(xiàng)積分相乘所得分0～2分記為陰性，3～4分記為弱陽性，5～8分記為中陽性，9～12分記為強(qiáng)陽性，本研究中將≥3分記為GRP78或GRP94高表達(dá)，<3分記為GRP78或GRP94低表達(dá)。

1.2.2GRP78、GRP94 mRNA檢測：以管家基因β-actin為內(nèi)參基因，應(yīng)用Trizol試劑提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑合成第一條DNA鏈，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：5℃，10 min；(95℃，15 s；60℃，45 s)×40；95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s；60℃，15 s。擴(kuò)增完畢后進(jìn)行葡聚糖凝膠電泳，采用系統(tǒng)自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software分析GRP78、GRP94的mRNA表達(dá)量，每個(gè)樣本重復(fù)3次取平均Ct值(若相差0.5個(gè)Ct值舍棄)，相對定量采用2-ΔΔCt法檢測癌組織及癌旁組織中GRP78 mRNA表達(dá)情況，其中ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(管家基因)，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對照組ΔCt。

1.2.3GRP78、GRP94蛋白相對表達(dá)量檢測：采用Western blotting檢測2組組織中GRP78、GRP94蛋白表達(dá)情況，收集GRP78、GRP94蛋白樣品，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白樣品的蛋白濃度，隨后應(yīng)用SDS-PAGE凝膠試劑盒(p0012A)配制SDS-PAGE凝膠，在收集的蛋白樣品中加適量SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃熱水中加熱，蛋白充分變性后待其冷卻，在室溫中將蛋白樣品直接上樣至SDS-PAGE凝膠加樣孔中即可，SDS-PAGE電泳液進(jìn)行電泳，待電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作(電流為300～400 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30～60 min)，轉(zhuǎn)膜時(shí)可使用多功能電泳儀，采用快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，隨后將蛋白膜放置在預(yù)先準(zhǔn)備好的洗滌液中漂洗，經(jīng)過一抗孵育-二抗孵育后，回收二抗，加洗滌液，共洗滌3次，采用BeyoECL pLUS試劑檢測蛋白。

1.2.4隨訪：生存時(shí)間以患者手術(shù)當(dāng)日為起點(diǎn)，隨訪截止日期(末次隨訪時(shí)間為術(shù)后3年)或患者死亡時(shí)間為終點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1GRP78、GRP94在不同食管組織中表達(dá)情況 食管癌腺癌組織GRP78和GRP94高表達(dá)率均高于食管鱗癌組織和癌旁組織，且鱗癌組織高于癌旁組織(P<0.05)。見表1。不同食管組織中GRP78免疫組化染色情況見圖1、2。

圖1 GRP78在不同食管癌組織及癌旁組織中的免疫組化染色情況(DAB×400)

圖2 GRP94在不同食管癌組織及癌旁組織中的免疫組化染色情況(DAB×400)

表1 GRP78、GRP94在不同食管組織中表達(dá)情況[例(%)]

2.2不同病理類型食管癌組織中GRP78、GRP94 mRNA、蛋白表達(dá)情況 食管癌腺癌組織GRP78 mRNA、GRP78蛋白相對表達(dá)量明顯高于食管癌鱗癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。食管癌腺癌組織GRP94 mRNA、GRP94蛋白相對表達(dá)量與食管癌鱗癌組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖3。

表2 不同病理類型食管癌組織中GRP78、GRP94 mRNA、蛋白表達(dá)情況

圖3 食管癌組織中GRP78、GRP94蛋白表達(dá)情況

2.3GRP78、GRP94表達(dá)水平與食管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析 GRP78高表達(dá)率與臨床分期、分化程度、病理類型有關(guān)，而GRP94高表達(dá)率與臨床分期、分化程度有關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 GRP78、GRP94與食管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析[例(%)]

2.4食管癌組織中GRP78、GRP94表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的分析 依據(jù)食管癌組織GRP78、GRP94表達(dá)水平高低分為GRP78低表達(dá)組、GRP94低表達(dá)組、GRP78高表達(dá)組、GRP94高表達(dá)組，78例食管癌患者均隨訪至術(shù)后3年，失訪率為0，隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)GRP78低表達(dá)組術(shù)后3年生存率76.47%(13/17)明顯高于GRP78高表達(dá)組40.98%(25/61)，GRP94低表達(dá)組術(shù)后3年生存率82.61%(19/23)明顯高于GRP94高表達(dá)組36.36%(20/55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、5。

圖4 GRP78高表達(dá)與低表達(dá)組食管癌患者的生存曲線GRP78為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

圖5 GRP94高表達(dá)與低表達(dá)食管癌患者的生存曲線GRP94為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94

3 討論

食管癌發(fā)生發(fā)展與多種環(huán)境因素以及人類基因組相互作用有關(guān)[7]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，食管癌演變過程為正常黏膜、基底細(xì)胞過度增生、不典型增生、原位癌、浸潤癌，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)水平不斷提高,食管癌手術(shù)切除率顯著升高，手術(shù)死亡率有所降低，但目前為止食管癌術(shù)后生存率仍不樂觀，主要是因?yàn)槭彻馨┤狈υ缙诘湫桶Y狀，臨床確診時(shí)多已失去最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)，因此食管癌早期診斷對改善患者預(yù)后尤為重要[8-9]。隨著分子生物學(xué)研究不斷深入，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)不少與食管癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子生物學(xué)指標(biāo)，近期有研究指出GRP78與腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等有關(guān)[10]，如卵巢癌、神經(jīng)細(xì)胞母細(xì)胞瘤、胃癌、肺癌等腫瘤中均可檢測到GRP78表達(dá)，GRP78也被稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，其作為一個(gè)重要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶常定位于真核生物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，有多種功能，如參與蛋白質(zhì)折疊及轉(zhuǎn)運(yùn)、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等生理過程[11-12]，相關(guān)研究證實(shí)GRP78可在一定程度上降低細(xì)胞對殺傷性T細(xì)胞的敏感度，阻礙細(xì)胞凋亡，而腫瘤細(xì)胞同樣存在GRP78的保護(hù)作用，GRP78同樣可降低細(xì)胞毒性T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞殺傷力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖以及耐藥性產(chǎn)生[13-14]。食管癌作為全球范圍內(nèi)危害人類生命安全的常見惡性腫瘤，早期準(zhǔn)確診斷其病理類型及預(yù)后對降低患者病死率有重要臨床意義。

GRP78、GRP94是糖調(diào)節(jié)蛋白家族中被研究最多的蛋白，主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中穩(wěn)定表達(dá)，在基礎(chǔ)表達(dá)水平上發(fā)揮重要的生理作用，董孝成等[15]對不同組織學(xué)類型食管癌GRP78表達(dá)及其臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行了探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)食管癌腺癌組織GRP78陽性率明顯高于食管癌鱗癌組織及正常食管組織，同時(shí)證實(shí)了GRP78可能參與了食管癌變發(fā)生過程；而胡永偉等[16]文獻(xiàn)報(bào)道則表明GRP78陽性患者的中位生存期為49.78個(gè)月(95%CI:44.09,55.46個(gè)月)短于陰性患者的62.21個(gè)月(95%CI:53.29,71.14個(gè)月)；Hsu等[17]研究也證實(shí)GRP78在腫瘤組織中呈高表達(dá)；關(guān)心等[18]研究則證實(shí)結(jié)直腸癌組織中GRP78、GRP94高表達(dá)可能與結(jié)直腸癌發(fā)生、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，或可作為腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的客觀指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，食管癌鱗癌組織GRP78、GRP94高表達(dá)率較食管癌癌旁組織明顯高，證實(shí)了GRP78、GRP94可能參與了食管癌疾病發(fā)生、發(fā)展病理過程中，與李洪標(biāo)等[19]研究的觀點(diǎn)大體相符；本研究結(jié)果還顯示，食管癌腺癌組織GRP78 mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯高于食管癌鱗癌組織，提示術(shù)前監(jiān)測食管癌患者GRP78表達(dá)水平或有利于臨床醫(yī)師為食管癌患者制定合理治療方案[20]。此外，本研究隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRP78、GRP94低表達(dá)組術(shù)后3年生存率高于GRP78、GRP94高表達(dá)組，提示GRP78、GRP94水平高低可較好預(yù)測食管癌患者預(yù)后狀況，未來GRP78、GRP94有望成為判斷食管癌預(yù)后的有效指標(biāo)。

綜上所述，本研究的創(chuàng)新之處是，初步證實(shí)了GRP78、GRP94與食管癌病理特征及其預(yù)后的關(guān)系，為食管癌患者的早期診斷、預(yù)后評估等方面提供了理論依據(jù)，臨床中或可通過嚴(yán)密監(jiān)測食管癌組織中GRP78表達(dá)情況，以預(yù)測腫瘤的惡性程度和預(yù)后狀況。