盛 濤，張少華，毛興波，趙國剛

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)通常指原發(fā)性肝癌，是肝臟上皮細(xì)胞惡性增殖形成，其具體發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，可能與病毒性肝炎、乙醇及各種化學(xué)致癌物質(zhì)有關(guān)[1-2]。HCC早期患者常缺乏特異性表現(xiàn)，起病隱匿但進(jìn)展迅速[3]，且現(xiàn)階段臨床尚無有效根治方案，因此預(yù)后情況一直不容樂觀，近年來隨著醫(yī)學(xué)水平發(fā)展和基因組學(xué)開展，惡性腫瘤分子生物學(xué)機(jī)制不斷被揭開和證實(shí)，為闡明惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制和進(jìn)行臨床治療提供了新的思路和靶點(diǎn)[4-5]。DNA聚合酶δ3(DNA polymerase delta 3， POLD3)為POLD第3亞基，是生命體染色體復(fù)制過程中重要的修復(fù)功能基因，對維持基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要意義，文獻(xiàn)報(bào)道，POLD3缺失或表達(dá)紊亂可能參與結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程[6-7]。本研究主要探討POLD3在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)水平及其與HCC臨床病理特征的關(guān)系，為明確HCC發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)，進(jìn)一步提升臨床治療水平提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年12月—2018年12月我院擬行手術(shù)治療的HCC患者97例為研究對象，男65例，女32例，年齡31～84(67.38±12.49)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)病理檢查結(jié)果證實(shí)[8]；②年齡≥18歲；③術(shù)前未行抗癌輔助治療；④明確未發(fā)生肝外轉(zhuǎn)移；⑤患者及家屬知曉本研究并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴活動性肝炎或脂肪肝等其他肝臟疾??；②伴嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病；③伴肝膽手術(shù)史或腹腔粘連者；④合并全身其他類型惡性腫瘤；⑤伴其他手術(shù)相關(guān)禁忌證；⑥臨床病理資料收集不完整者。

1.2方法 術(shù)中收集97例HCC患者癌組織和癌旁組織標(biāo)本，經(jīng)10%中性福爾馬林固定24 h后進(jìn)行石蠟包埋、切片和HE染色，復(fù)核病理診斷和分期，其中癌組織標(biāo)本要求腫瘤組織成分≥90%，癌旁組織取自腫瘤遠(yuǎn)端切緣處，經(jīng)HE染色確定無腫瘤成分，采用POLD3抗體和試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))按EnVision兩步法進(jìn)行免疫組化染色，所有操作均嚴(yán)格遵循說明書要求執(zhí)行，在400倍光鏡下隨機(jī)選取10個視野對染色細(xì)胞數(shù)量和染色程度進(jìn)行評分，其中陽性細(xì)胞數(shù)量<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色程度:無染色為0分，淺棕色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，棕黑色為4分；根據(jù)免疫組化反應(yīng)評分(IRS)標(biāo)準(zhǔn)[9]，POLD3表達(dá)水平為陽性細(xì)胞數(shù)量評分×染色程度評分，本研究以IRS>3分為高表達(dá)，≤3分為低表達(dá)，同時采集患者臨床和病理資料，并分析不同POLD3表達(dá)水平HCC患者的臨床病理特征。

2 結(jié)果

2.1HCC癌組織和癌旁組織病理學(xué)表現(xiàn) 癌組織細(xì)胞鏡下大小和形狀各異，可見核分裂象和腫瘤巨細(xì)胞，生長方式呈柱狀、團(tuán)狀或?yàn)V泡狀，并可見乳頭狀結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞周圍為肝竇樣血管網(wǎng)，部分血管可內(nèi)襯非典型核分裂象腫瘤細(xì)胞(圖1A)；癌旁組織顯示肝小葉基本正常，小葉間結(jié)締組織減少，常相互連接成片狀，可見中央靜脈及周圍呈放射狀排列的肝索和肝竇，細(xì)胞強(qiáng)嗜酸性，形態(tài)和大小未見明顯異型性(圖1B)。

圖1 HCC癌組織和癌旁組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE×400)

2.2HCC癌組織和癌旁組織中POLD3表達(dá)水平 POLD3陽性定位于細(xì)胞核，顏色自淺棕色至棕黑色不等。見圖2。HCC癌組織中POLD3高表達(dá)率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖2 HCC癌組織和癌旁組織POLD3表達(dá)情況(EnVision×400)

HCC為肝細(xì)胞癌;A.癌組織；B.癌旁組織

表1 HCC癌組織和癌旁組織中POLD3表達(dá)水平分析[例(%)]

2.3癌組織POLD3表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系 POLD3低表達(dá)與HCC患者腫瘤數(shù)量、直徑、TNM分期、合并門靜脈癌栓及分化程度有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 HCC癌組織POLD3表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系[例(%)]

2.4癌組織POLD3表達(dá)水平對HCC預(yù)后影響 HCC術(shù)后均隨訪5年，其中POLD3高表達(dá)者失訪3例，生存時間57(51.0～63.1)個月，低表達(dá)者失訪1例，生存時間52(45.4～58.6)個月。2組生存時間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 POLD3表達(dá)水平對HCC患者預(yù)后的影響

3 討論

HCC是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一[10]，其發(fā)病率和病死率分別位于全球第六和第二，每年新增患者數(shù)量約70萬，受環(huán)境和生活習(xí)慣等因素影響，不同地區(qū)HCC發(fā)病和死亡情況差異較大，我國為HCC高發(fā)地區(qū)，患者數(shù)量在全球占比高達(dá)55%，發(fā)病率為(145～190)/10萬，死亡率為20.37/10萬，嚴(yán)重危害社會群眾身心健康和生命安全，給醫(yī)療衛(wèi)生工作帶來沉重壓力，因此結(jié)合我國居民生活環(huán)境和身體素質(zhì)，探討HCC發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制及其治療靶點(diǎn)，是現(xiàn)階段臨床需要解決的重要難題[11-13]。

惡性增殖是不同癌細(xì)胞典型生物學(xué)行為，而細(xì)胞增殖關(guān)鍵環(huán)節(jié)為DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，POLD通過與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)相互作用而參與調(diào)解DNA擴(kuò)增、復(fù)制和損傷修復(fù)過程，因此推測癌細(xì)胞增殖過程可能與POLD表達(dá)或結(jié)構(gòu)異常有關(guān)，POLD全酶由p125、p50、p66和p12四個亞基組成，在核苷酸切除修復(fù)(NER)、錯配修復(fù)(MMR)及堿基切除修復(fù)(BER)等常見DNA損傷修復(fù)方式中均有涉及和參與，其中POLD3即p66是POLD與PCNA交互作用過程的功能結(jié)合域，同時還能增加整個聚合酶穩(wěn)定性及與PCNA的親和力，對維持POLD功能具有重要意義，POLD3表達(dá)異常可能導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)功能異常，從而引起癌癥等疾病發(fā)生和進(jìn)展[14-17]。Rayner等[18]報(bào)道顯示，POLD3基因系突變可增加直腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究分析HCC患者POLD3表達(dá)水平顯示癌組織中僅23.71%為高表達(dá)，而癌旁組織88.66%為高表達(dá)，可見HCC患者癌組織POLD3表達(dá)水平較正常組織明顯偏低，因此POLD3低表達(dá)可能是HCC發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制之一。文獻(xiàn)報(bào)道，POLD在DNA合成中的作用取決于是否存在PCNA，但幾乎參與了所有方式的DNA損傷修復(fù)，因此POLD在介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)和保持染色體穩(wěn)定性方面的作用較復(fù)制合成更為重要和關(guān)鍵，因此核心亞基POLD3表達(dá)下降的主要影響是DNA損傷修復(fù)障礙，而HCC發(fā)生則可能與無法修復(fù)或未及修復(fù)的DNA產(chǎn)生克隆性進(jìn)而異常增殖有關(guān)[19-20]。

Willis等[21]研究報(bào)道，卵巢癌單基因生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)POLD3低表達(dá)患者預(yù)后較差，認(rèn)為POLD3可作為卵巢癌潛在治療靶點(diǎn)。為進(jìn)一步研究POLD3表達(dá)水平降低對HCC的影響，本研究將不同POLD3表達(dá)水平的HCC患者臨床病理特點(diǎn)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示POLD3低表達(dá)患者腫瘤單發(fā)數(shù)量和直徑增加，分化程度降低，TNM分期更晚且合并門靜脈癌栓的比例較大，可見POLD3低表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞去分化和增殖，故而POLD3表達(dá)下降不僅參與HCC發(fā)病，還可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和生長速度加快，分化程度降低且發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加，故而患者預(yù)后可能相對更差，同時提示以POLD3作為靶點(diǎn)進(jìn)行治療可能改善HCC癌細(xì)胞惡性行為，對控制病情進(jìn)展和改善預(yù)后具有重要意義。本研究中所有HCC患者術(shù)后均隨訪5年，2組中位生存時間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能與樣本容量偏小和術(shù)后治療措施干預(yù)等因素有關(guān)，這也是本研究不足之處，其結(jié)果是否具有普適性和推廣意義還有待觀察，同時POLD3表達(dá)水平降低的原因、POLD不同亞基間的相互作用，以及POLD3影響HCC臨床病理特點(diǎn)的詳細(xì)機(jī)制等也尚不明確，因此需要后續(xù)更多臨床和實(shí)驗(yàn)室研究進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述，POLD3在HCC患者癌組織中表達(dá)水平降低，可能在HCC發(fā)病和進(jìn)展過程中均發(fā)揮重要作用，為HCC診斷、治療和預(yù)后評估提供了新的思路和靶點(diǎn)。