液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析監(jiān)測馬鈴薯中的主要糖苷生物堿

任興權，蘇菊，蘇阿龍王蓉，劉盼*

1(酒泉市食品檢驗檢測中心，甘肅 酒泉， 735000)2(甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州，730000)

馬鈴薯是當今世界第四大糧食作物，在貯藏中，受光照、溫度等因素的影響，馬鈴薯易變綠或發(fā)芽，在這一過程中產(chǎn)生了以茄啶為糖苷配基構成的一類生物堿[1]，俗稱為龍葵素，其成分為α-茄堿、β-茄堿、γ-茄堿、α-卡茄堿、β-卡茄堿、γ-卡茄堿，其中α-茄堿和α-卡茄堿的含量占總的糖苷生物堿的95%。龍葵素有較強的毒性[2-15]，當一次攝入量超過200 mg時就會引起急性中毒，攝入量更高時就會導致舌頭發(fā)麻、腹瀉、嘔吐、發(fā)熱、頭痛、血壓下降，甚至耳鳴、昏迷、抽搐、瞳孔放大，呼吸中樞麻痹而死亡。長期食用龍葵素含量較高的馬鈴薯還會致畸和脊柱裂?？茖W、準確地分析馬鈴薯中的α-茄堿、α-卡茄堿的含量關聯(lián)著每一個人的身體健康。

目前已報道的馬鈴薯中主要糖苷生物堿α-茄堿、α-卡茄堿的分析監(jiān)測方法有比色法[16]、液相色譜法[17-28]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[29-35]，后2種方法研究得比較多。邵慧凱等[17]用異丁醇萃取馬鈴薯中的α-茄堿，在210 nm波長處檢測。趙丹青等[18]用乙醇-乙酸溶液提取茄堿后過SPE NH2小柱，用甲醇-二氯甲烷洗脫，液相色譜檢測。張舵[23]用無水乙醇-乙酸溶液提取后液相色譜檢測。王建鳳等[29]用V(1%甲酸)∶V(乙醇)=1∶1提取，采用液相-質(zhì)譜法檢測。劉紅河等[30]用V(甲酸)∶V(乙醇)=1∶1作為溶劑提取，并且用MCX固相萃取柱萃取后用高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測馬鈴薯及制品中α-茄堿。戴超等[32]用V(乙酸)∶V(乙醇)=1∶10混合溶劑振蕩提取后運用液質(zhì)聯(lián)法分析貯藏對馬鈴薯中α-茄堿含量的影響。張春嬌等[33]采用10%乙酸提取后并且經(jīng)C18SPE小柱凈化后用液-質(zhì)法檢測。現(xiàn)有的液相色譜法和液相-質(zhì)譜聯(lián)用法普遍存在的問題是前處理提取繁瑣、提取效果不理想，分析的色譜和質(zhì)譜條件沒有達到最佳。

本研究創(chuàng)新了前處理方法，樣品用酸化甲醇提取后，用無水硫酸鈉和無水乙酸鎂吸收水分后離心，以期改善提取效果優(yōu)化液相和質(zhì)譜條件，對馬鈴薯中主要糖苷生物堿α-茄堿和α-卡茄堿進行高效快捷的分析和監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯，市購。

甲醇、乙腈(均為色譜純)，默克股份兩合公司；甲酸(色譜純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；無水硫酸鈉、無水乙酸鎂、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉、乙酸、乙醇、異丁醇(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；KH2PO4、甲酸銨、乙酸銨(均為色譜純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；α-茄堿(C45H73NO15，CAS號：20562-02-1，純度≥99.9%)，多倫多研究化學公司;α-卡茄堿(C45H73NO14，CAS號：20562-03-2，純度≥99.9%)，ChromaDex公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6460電噴霧-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；艾柯Advanced-Ⅱ-12型高純水機，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；寧波新芝SB25-12DTD型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技有限公司；長沙英泰TG16型離心機，長沙英泰儀器有限公司；IKA MS3型渦旋混合器，IKA公司；賽多利斯SQP型電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；梅特勒PL602E/02便攜式天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 液相色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm);流動相A為1 mmol/L酸化甲酸銨溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫0.0～4.0 min,90%A; 4.0～5.0 min,10%A; 5.0～7.0 min,90%A。流速為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃，進樣量為5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離正離子模式，電噴霧電壓4 000 V,離子源溫度350 ℃，霧化器壓力20 psi。

1.3.3 標準曲線溶液的配制

分別稱取10 mg α-茄堿和α-卡茄堿于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1 mg/mL的標準儲備液；用甲醇逐級稀釋成1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的混合標準系列溶液。

1.3.4 樣品預處理

用均質(zhì)器將樣品充分打碎混勻，放入分裝容器中，密封并標記，于-20 ℃以下冷凍存放。

稱取試樣1.0 g(精確至0.001 g)于50 mL具塞離心管中，加入3.0 mL水渦旋混勻1 min，再準確加入25.0 mL酸化甲醇(1%甲酸+99%甲醇)，渦旋1 min。之后，向離心管中加入2.0 g 無水硫酸鈉，1.0 g 無水乙酸鎂。手動劇烈搖動1 min后渦旋1 min。再將離心管置于離心機中，在室溫條件下以10 000 r/min的速度，離心5 min。取50 μL上清液于10 mL容量瓶中，加入甲醇水溶液(40%甲醇)定容至刻度，過微孔濾膜(0.22 μm，尼龍)后上機測定。

1.3.5 定性、定量方法

以α-茄堿和α-卡茄堿保留時間定性，以外標法對α-茄堿和α-卡茄堿進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 提取方式的選擇

馬鈴薯中α-茄堿、α-卡茄堿的文獻報道提取方法主要有乙酸水溶液法、乙醇法、乙醇-乙酸混合劑法、異丁醇萃取法、乙酸-乙腈、乙醇-乙腈等，通過實驗驗證均能不同程度的提取，可是提取效果均不理想，達不到完全提取。本研究先加入少量水溶后再用酸化甲醇提取，加入無水硫酸鈉、無水乙酸鎂吸收多余的水，最后在高速離心機上離心。通過對不同方法的試驗對比得出酸化甲醇能夠最大限度的提取茄堿，無水硫酸鈉、無水乙酸鎂有很強的吸水性。在酸性、含水量少的環(huán)境中α-茄堿、α-卡茄堿易溶于甲醇，酸化甲醇、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉同時作用為α-茄堿、α-卡茄堿的提取創(chuàng)造了最佳的環(huán)境。對一樣品均質(zhì)后等量稱取7份分別用本方法及文獻報道效果較好的方法處理提取后分析，測定2次的平均含量情況，如圖1所示。由圖1可以看出本法的前處理方法比文獻報道的前處理方法提取效果更好。

圖1 不同前處理試劑的提取效果圖Fig.1 Extraction effect of different pretreatment reagents

2.2 儀器條件的選擇

2.2.1 質(zhì)譜條件的選擇

在正離子模式下，對α-茄堿、α-卡茄堿進行母離子和子離子掃描，優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 α-茄堿和α-卡茄堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters of α-solanine and α-chaconine

2.2.2 色譜柱的選擇

對Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)與OmniBond HPLC Hubble C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Allure PFP Propyl C18(100 mm×2.1 mm,5 μm)4種色譜柱進行了對比，α-茄堿和α-卡茄堿在Agilent Eclipse Plus C18色譜柱上分離效果最好，柱效高，選擇性高，pH穩(wěn)定性好，峰型對稱尖銳。

2.2.3 流動相體系的選擇

分別考察了檢測α-茄堿和α-卡茄堿的流動相體系乙腈-水、甲醇-水、1 mmol/L乙酸-乙酸銨溶液+甲醇、1 mmol/L甲酸-甲酸銨溶液+甲醇、1 mmol/L乙酸-乙酸銨溶液+乙腈、1 mmol/L甲酸-甲酸銨溶液+乙腈等流動相體系的對α-茄堿和α-卡茄堿的分離效果，發(fā)現(xiàn)當流動相體系為1 mmol/L甲酸-甲酸銨溶液+乙腈時分離效果最佳。

2.2.4 流動相淋洗方式的選擇

對流動相采用等度淋洗和梯度淋洗時的效果進行了對比，發(fā)現(xiàn)梯度淋洗的效果更好一些，設置不同梯度洗脫程序進行效果驗證，當梯度洗脫程序為0.0～4.0 min,90%A; 4.0～5.0 min,10%A; 5.0～7.0 min,90%A時，洗脫效果最優(yōu)。

2.2.5 流動相流速的選擇

分別對流速為0.10、0.20、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60 mL/min時的分離效果進行了比對。結果表明，隨著流速的增大，保留時間縮短，α-茄堿和α-卡茄堿的保留時間越接近。綜合保留時間、響應值、分離度等因素，流動相流速為0.4 mL/min時適宜。在此優(yōu)化的質(zhì)譜和液相條件下，α-茄堿和α-卡茄堿的標準譜圖見圖2和圖3，樣品中α-茄堿和α-卡茄堿的譜圖見圖4和圖5。

圖2 10.0 ng/mL α-茄堿標準溶液的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of 10.0 ng/mL α-solanine standard solution

圖3 10.0 ng/mLα-卡茄堿標準溶液的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of 10.0 ng/mL α-chaconine standard solution

圖4 樣品中α-茄堿的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of α-solanine in sample

圖5 樣品中α-卡茄堿的MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatogram of α-chaconine in sample

2.3 標準曲線與檢出限

分別以質(zhì)量濃度(X, ng/mL)為橫坐標、響應值(Y)為縱坐標繪制標準曲線，α-茄堿和α-卡茄堿的線性方程及其相關系數(shù)見表2，可以看出在濃度為1.0～100 ng/mL時，2種茄堿的線性關系良好，相關系數(shù)(R2)為0.999 3～0.999 5，滿足定量分析的要求。

表2 α-茄堿和α-卡茄堿的線性方程、相關系數(shù)(R2)、及其方法檢出限Table 2 Linear equation, correlation coefficient (R2) and detection limit of α-solanine and α-chaconine

以不含茄堿的新鮮馬鈴薯肉作為空白基質(zhì)，在其中加入低濃度α-茄堿和α-卡茄堿，按照本研究的上述方法進行前處理和分析檢測，以3倍、10倍信噪比計算得到本方法中α-茄堿和α-卡茄堿的檢出限均為0.3 mg/kg，定量限均為1.0 mg/kg。比對文獻報道的同類分析檢測的情況，本方法的靈敏度較高。

2.4 回收率和精密度

選用已分析α-茄堿和α-卡茄堿含量的馬鈴薯芽，分別添加10.0、50.0、100.0 ng/mL低、中、高3個濃度水平的α-茄堿和α-卡茄堿混合標準溶液,配成加標樣品，按照上述方法進行前處理，每個加標水平的樣品平行分析6次，結果加標回收率為98.9%～101.6%，相對標準偏差為0.18%～1.41%，具體數(shù)據(jù)見表3，說明本方法有較高的準確度和精密度，完全適合馬鈴薯中α-茄堿和α-卡茄堿的分析監(jiān)測。

表3 α-茄堿和α-卡茄堿的回收率和精密度Table 3 Recoeries and RSDs of α-solanine and α-chaconine

2.5 馬鈴薯樣品分析

用本方法對任意選取的馬鈴薯綠芽、綠皮、芽下肉、肉4種樣品中α-茄堿和α-卡茄堿總含量進行分析檢測，結果馬鈴薯綠芽中的總含量為8 516 mg/kg, 馬鈴薯綠皮中的總含量為5 055 mg/kg, 馬鈴薯芽下肉中的總含量為830 mg/kg, 馬鈴薯肉中的總含量為166 mg/kg，從檢測結果可看出，馬鈴薯芽中的α-茄堿和α-卡茄堿含量是非常高的，從馬鈴薯綠芽、綠皮、芽下肉、肉依次降低。

2.6 與補充方法的對比

分別用本方法和補充方法土豆及其制品中α-茄堿和α-卡茄堿含量測定(BJS201806)對馬鈴薯的白芽、綠芽、綠芽加標進行前處理提取及分析，分析結果見表4，可以看出2種方法的檢測結果相對偏差在3.2%～11.2%，采用本方法提取及分析的含量明顯比補充方法提取及分析的含量高，同時在馬鈴薯綠芽添加10 ng/mL濃度水平的α-茄堿和α-卡茄堿標準混合溶液后分析，通過分析結果得出本方法的加標回收率為98.4%～102.8%，BJS201806補充方法的加標回收率為81.6%～90.9%，進一步證明了本方法不論是前處理提取還是分析條件都比補充方法更優(yōu)。

表4 本方法與補充方法檢測結果的對比Table 4 Comparison between the results of this method and the supplementary method

3 結論

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析監(jiān)測馬鈴薯中主要糖苷生物堿α-茄堿和α-卡茄堿的方法。利用酸化甲醇提取，用無水硫酸鈉和無水乙酸鎂吸收多余的水分后，在電噴霧正離子模式下，采用四級桿質(zhì)譜儀進行分析檢測。與文獻報道的方法相比，本法操作簡單、重現(xiàn)性好、準確度高，完全滿足馬鈴薯及其制品中α-茄堿和α-卡茄堿的分析監(jiān)測，對于食用農(nóng)產(chǎn)品的安全監(jiān)管提供了強有力的技術支撐，對保障公眾食品安全具有重要的社會意義。