當(dāng)歸保健藥酒中肉桂薄層鑒別和阿魏酸含量測(cè)定※

周 和，王 奧

(1.遵義市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 遵義563002；2.遵義產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州 遵義563002)

保健藥酒是中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)的重要組成部分，有著數(shù)千年的應(yīng)用歷史及其治疾健身記載[1]。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，藥酒在酒浸中藥傳統(tǒng)工藝基礎(chǔ)上，通過(guò)萃取、浸提和生物工程等現(xiàn)代化手段提取中藥中有效成分而成。藥借酒力，酒助藥勢(shì)，可充分發(fā)揮其效力。當(dāng)歸保健藥酒包含當(dāng)歸、肉桂、黃芪等十余味中藥[2]，具有活血化瘀、抗疲勞等功效，用于改善氣虛乏力、疲勞等癥狀。當(dāng)歸中阿魏酸具有清除自由基、抗血栓、抑制腫瘤、增強(qiáng)精子活力、防治高血壓及心臟病等保健功能，是當(dāng)歸保健藥酒中的重要指標(biāo)性成分[3]。肉桂具有補(bǔ)火助陽(yáng)、引火歸元、散寒止痛、溫通經(jīng)脈的功效，在該藥酒中用量?jī)H次于當(dāng)歸[2]。薄層鑒別用于判斷投料藥材的真?zhèn)?，含量測(cè)定用于評(píng)價(jià)指標(biāo)性成分的多少。本研究對(duì)當(dāng)歸保健藥酒進(jìn)行肉桂薄層鑒別[2-4]及當(dāng)歸中阿魏酸含量測(cè)定[5-8]，以期為當(dāng)歸保健藥酒質(zhì)量控制奠定一定的研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國(guó)Agilent-1260高效液相系統(tǒng)，Waters XSelect HSS T3(4.6 mm×250 mm，5μm)色譜柱；梅特勒-托利多XPE56型十萬(wàn)分之一電子天平，梅特勒-托利多MS204TS型萬(wàn)分之一電子天平，KQ-500DV型超聲波清洗機(jī)。

1.2 試藥與試劑 當(dāng)歸保健藥酒(遵義融昇酒業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)20150101，20150102，20150103)，陰性樣品(批號(hào)20180001，不含肉桂；20180002，不含當(dāng)歸)，硅膠G板(青島海洋化工廠(chǎng)有限公司，批號(hào)20170818)。肉桂對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110786-201703)和當(dāng)歸中阿魏酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111773-201614)，甲醇、醋酸為色譜純，其他實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

2 肉桂薄層色譜鑒別

2.1 TLC方法 取當(dāng)歸保健藥酒約100 mL，置250 mL分液漏斗中，加二氯甲烷15 mL振搖提取，重復(fù)2次，合并二氯甲烷提取液，60℃以下水浴中揮發(fā)至約1 mL，作為供試品溶液；陰性樣品溶液(20180001，不含肉桂)同法制備。另取肉桂對(duì)照藥材1 g，用20 mL 50%乙醇溶液超聲處理15 min，過(guò)濾，取濾液同法制備肉桂對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，依次點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(17∶3)為展開(kāi)劑，晾干后噴二硝基苯肼乙醇試液[2-4]。

2.2 TLC結(jié)果 在當(dāng)歸保健藥酒供試品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上，成功檢測(cè)出相同顏色的肉桂對(duì)照藥材主斑點(diǎn)，Rf值(比移值)適中，陰性樣品無(wú)干擾。(見(jiàn)圖1，掃描文章標(biāo)題處二維碼，下同)。

3 當(dāng)歸中阿魏酸含量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱：Waters XSelect HSS T3(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動(dòng)相：0.5%冰醋酸水溶液-甲醇(73∶27)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：316 nm；柱溫：25℃[8]。

3.2 溶液制備

(1)阿魏酸對(duì)照品溶液 取阿魏酸對(duì)照品適量，用XPE56型十萬(wàn)分之一電子天平精密稱(chēng)定，置容量瓶中，加甲醇稀釋制成32.80μg/mL的對(duì)照品貯備液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ倬芪?chǔ)備液適量，依次稀釋配置成5個(gè)不同濃度(0.82、1.64、3.28、6.56、13.12μg/mL)的阿魏酸對(duì)照品溶液。

(2)當(dāng)歸保健藥酒供試品溶液 精密量取當(dāng)歸保健藥酒50 mL，置于100 mL蒸發(fā)皿中，90℃水浴蒸干，殘?jiān)?0 mL水分3次(每次10 mL)溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL分液漏斗中，用乙醚振搖萃取3次(分別長(zhǎng)15、15、10 mL)，水浴揮發(fā)，殘?jiān)? mL甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，再用4 mL甲醇分2次洗滌蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)移到容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

(3)陰性樣品溶液 取陰性樣品(20180002，不含當(dāng)歸)，按“3.2(2)”項(xiàng)下制備方法制備，作為陰性樣品溶液。

3.3 方法學(xué)考察

(1)系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按“3.1”項(xiàng)下色譜條件取樣，記錄對(duì)照品、當(dāng)歸保健藥酒供試品、陰性樣品色譜圖。對(duì)照品和供試品溶液中各化合物色譜峰均達(dá)到基線(xiàn)分離，與相鄰色譜峰的分離度＞1.5，且陰性樣品無(wú)干擾(見(jiàn)圖2)。

(2)線(xiàn)性關(guān)系 分別精密吸取10μL不同濃度阿魏酸對(duì)照品溶液(0.82、1.64、3.28、6.56、13.12μg/mL)，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(m Au)為縱坐標(biāo)，繪制阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得線(xiàn)性方程Y＝48.45X－0.439(r＝0.9999)。結(jié)果表明0.82～13.12μg/mL濃度范圍內(nèi)，阿魏酸呈良好線(xiàn)性關(guān)系，適用于當(dāng)歸保健藥酒中阿魏酸含量測(cè)定。

(3)精密度 取3.28μg/mL的阿魏酸對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積，平均峰面積為161.12，RSD(n＝6)為0.38%，表明儀器精密度良好。

(4)重復(fù)性 取當(dāng)歸保健藥酒(20150102)50 mL，分別制備6份當(dāng)歸保健藥酒供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積。外標(biāo)法計(jì)算獲得指標(biāo)性成分阿魏酸的平均含量為0.5454 mg/L，RSD(n＝6)為0.73%，重復(fù)性良好。

(5)穩(wěn)定性 取當(dāng)歸保健藥酒(20150102)供試品溶液，依次在0、2、5、10、16、24 h測(cè)定，平均峰面積為133.79，RSD(n＝6)為1.39%。結(jié)果表明在室溫條件下，當(dāng)歸保健藥酒供試品溶液保存24 h，對(duì)阿魏酸含量測(cè)定無(wú)顯著影響。

(6)加標(biāo)回收 分別取已知含量的當(dāng)歸保健藥酒樣品6份(平均含量0.545 4 mg/L)，每份25 mL，精密加入對(duì)照品溶液(濃度為0.013 12 mg/mL)1 mL，按“3.2(2)”項(xiàng)下制備方法制備，即得。按“3.1”色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算阿魏酸回收率。結(jié)果表明平均回收率為99.50%，RSD(n＝6)為1.07%。見(jiàn)表1。

表1 當(dāng)歸保健藥酒樣品阿魏酸回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.4 樣品檢測(cè) 取3批當(dāng)歸保健藥酒供試品溶液，每次取3份，按外標(biāo)法依次測(cè)定并計(jì)算阿魏酸含量。見(jiàn)表2。

表2 當(dāng)歸保健藥酒阿魏酸含量測(cè)定結(jié)果(mg/L)

4 討論

當(dāng)歸保健藥酒中含多味中藥，成分較多，筆者前期取當(dāng)歸保健藥酒100 mL，水浴濃縮至約1 mL，作為當(dāng)歸保健藥酒供試品溶液，得到TLC斑點(diǎn)多，背景干擾較大，目標(biāo)色譜斑點(diǎn)模糊。采用肉桂TLC方法成功檢測(cè)出相同顏色的肉桂對(duì)照藥材主斑點(diǎn)，Rf值適中，陰性樣品無(wú)干擾，并按照國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則實(shí)施細(xì)則》的相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)耐用性考察，重現(xiàn)性良好。選擇乙腈-0.085%磷酸水溶液(17∶83)、0.5%冰醋酸水溶液-甲醇等多種流動(dòng)相[5-8]進(jìn)行阿魏酸含量測(cè)定，確定了適用于本研究的流動(dòng)相比例，達(dá)到了較好的分離效果。本研究建立當(dāng)歸保健藥酒中肉桂薄層鑒別及指標(biāo)性成分阿魏酸的含量測(cè)定方法，具有簡(jiǎn)捷快速、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，可為當(dāng)歸保健藥酒質(zhì)量控制提供一定的參考。