武文艷, 劉新香, 周秒依, 劉金香, 劉亞

北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心, 玉米DNA指紋及分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100097

根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(The International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications，ISAAA)統(tǒng)計(jì)，2018年種植或進(jìn)口轉(zhuǎn)基因作物的國家和地區(qū)共計(jì)70個(gè)，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到1.9億hm2。自1996年以來，轉(zhuǎn)基因作物種植面積累計(jì)達(dá)25億hm2，約增加了113倍，堪稱全球普及速度最快的作物技術(shù)[1]。玉米是用途最為廣泛的糧食作物，同時(shí)也是全球種植范圍最廣、產(chǎn)量最大的谷類作物，2018年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的30.7%為轉(zhuǎn)基因玉米，轉(zhuǎn)基因玉米種植面積高達(dá)到5 890萬hm2，從全球單一作物的種植面積看，2018年轉(zhuǎn)基因玉米的應(yīng)用率為30%[1]。

隨著各國對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品閾值管理和標(biāo)識(shí)制度的相繼建立實(shí)施，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定量檢測(cè)成為必然趨勢(shì)，越來越多的檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)因其實(shí)時(shí)、快速、高效和準(zhǔn)確定量的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測(cè)[2]。目前已經(jīng)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因玉米品種NK603、MON88017、MIR162等均已建立了品系特異定量PCR檢測(cè)方法[3-5]。微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)是一種對(duì)核酸分子進(jìn)行絕對(duì)定量的方法，該方法在傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，每個(gè)微滴不含或含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢測(cè)的核酸靶分子，在PCR擴(kuò)增后，對(duì)每個(gè)微滴逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)泊松分布原理，計(jì)算出核酸靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度，從而實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量的目的。相比于實(shí)時(shí)熒光PCR，數(shù)字PCR具有更好的測(cè)量獨(dú)立性，且數(shù)字PCR無需任何校準(zhǔn)物，具有更高的穩(wěn)定性、特異性、靈敏度和精確性等優(yōu)點(diǎn)[6]。

利用ddPCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米、水稻植株的基因拷貝數(shù)檢測(cè)分析，相比于傳統(tǒng)的Southern blot，ddPCR技術(shù)分析更為簡(jiǎn)便、快速[7-8]。Fu等[9]通過運(yùn)用ddPCR技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的通用元件CaMV35s啟動(dòng)子和NOS終止子進(jìn)行定量檢測(cè)，特異性驗(yàn)證了MON810、MON863等9種轉(zhuǎn)基因品系，該方法的檢測(cè)限為0.1%，低于歐盟規(guī)定的標(biāo)識(shí)閾值水平，表明該方法的靈敏度高、特異性好，可對(duì)轉(zhuǎn)基因成分含量進(jìn)行精確定量檢測(cè)。周圓等[10]運(yùn)用數(shù)字PCR技術(shù)，建立了基于TC1507、MIR162、MIR604 3種轉(zhuǎn)基因玉米品系的二重微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)檢測(cè)方法，研究表明該方法的靈敏度高且特異性強(qiáng)，可應(yīng)用于進(jìn)出口農(nóng)產(chǎn)品中這3種轉(zhuǎn)基因玉米品系成分的定量檢測(cè)。

轉(zhuǎn)基因玉米2A-5是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的具有抗玉米螟蟲的轉(zhuǎn)化體，含有3個(gè)外源基因(mCry1Ab、mCry2Ab和bar)表達(dá)盒，目前仍缺乏特異性定性及定量檢測(cè)方法。本研究的目的是根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米2A-5的旁側(cè)序列，設(shè)計(jì)合成ddPCR反應(yīng)的引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，建立轉(zhuǎn)基因玉米2A-5及其衍生品種的特異性定性定量的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因玉米2A-5純合種子樣品由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，作為陰性對(duì)照的非轉(zhuǎn)基因玉米樣品由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

DNA提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)有限公司；Premix ExTaq(Probe qPCR)實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒均購自TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；引物及探針由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成；熒光PCR儀選用ABI Q5(美國ABI 公司)；數(shù)字PCR儀選用 QX200 Droplet Digital PCR系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；分光光度計(jì)選用Nanodrop 1000分光光度計(jì)(美國Nanodrop公司)。

1.3 DNA提取

轉(zhuǎn)基因玉米2A-5種子發(fā)芽后，用DNA試劑盒(CWBio)提取試驗(yàn)材料的DNA，提取樣品的濃度用Nanodrop 1000分光光度計(jì)測(cè)定。

1.4 引物設(shè)計(jì)及最佳引物組合的篩選

運(yùn)用Primer Premier 5.0在外源插入序列及左右邊界側(cè)翼序列分別設(shè)計(jì)單向引物，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度范圍為100～300 bp，共設(shè)計(jì)18個(gè)引物探針組合，其中5′端11對(duì)，3′端7對(duì)(表1)。以2A-5基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增，篩選特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增穩(wěn)定的引物探針組合。進(jìn)行引物探針篩選，根據(jù)結(jié)果選擇擴(kuò)增信號(hào)最強(qiáng)、Ct值最小的引物探針組合作為候選。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)候選引物信息表Table1 The informations of real-time PCR candidate primers

1.5 實(shí)時(shí)熒光PCR方法

反應(yīng)體系：2A-5 PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL Premix ExTaq(Probe qPCR)、0.8 μL 2A-5-5-QF8(10 μmol·L-1)、0.8 μL 2A-5-5-QR8(10 μmol·L-1)、0.4 μL 2A-5-5-QP8(10 μmol·L-1)、0.4 μL ROX Reference Dye、2 μL的DNA模板、5.6 μL無核酸酶水，ddH2O補(bǔ)足混勻。玉米內(nèi)參基因zSSⅡb反應(yīng)體系除引物探針外與2A-5 PCR反應(yīng)體系相同，zSSⅡb-QF：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′，zSSⅡb-QR：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCC-TC-3′，zSSⅡb-QP：5′-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3′。將混勻后的PCR管放在離心機(jī)上，500～3 000 g離心10 s，然后取出PCR管，放入PCR儀中，運(yùn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s,40個(gè)循環(huán)；在第二階段的退火延伸(60 ℃)時(shí)段收集熒光信號(hào)。每個(gè)試樣PCR擴(kuò)增設(shè)置3次平行。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將2A-5基因組DNA做2倍梯度稀釋分別為80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625和0.313 ng·μL-1，用于qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別以內(nèi)參基因zSSⅡb和2A-5特異性序列引物及探針進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，Ct值(熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù))作為縱坐標(biāo)，繪制內(nèi)參基因和2A-5特異性序列標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求解回歸方程。

根據(jù)Ct值與zSSⅡb基因含量和2A-5特異序列的不同含量，繪制Ct值與zSSⅡb基因含量、2A-5特異序列的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算出2A-5樣品中內(nèi)源參考基因zSSⅡb和2A-5特異序列片段的絕對(duì)含量，再根據(jù)以下公式計(jì)算出樣品中2A-5目標(biāo)基因的相對(duì)含量=(外源基因拷貝數(shù)/內(nèi)源參考基因拷貝數(shù))×100%。

1.6 數(shù)字PCR方法

數(shù)字PCR反應(yīng)體系：10 μL ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)、0.7 μL 2A-5-5-QF8(10 μmol·L-1)、0.7 μL 2A-5-5-QR8(10 μmol·L-1)、0.25 μL 2A-5-5-QP8(10 μmol·L-1)、0.7 μLzSSⅡb-QF(10 μmol·L-1)、0.7 μLzSSⅡb-QR(10 μmol·L-1)、0.25 μLzSSⅡb-QP(10 μmol·L-1)、1 μL DNA模板、5.7 μL無核酸酶水，混勻。

微滴生成：將含有樣品的20 μL ddPCR預(yù)混液與70 μL微滴生成油加入微滴發(fā)生卡，覆蓋專用膠墊后放入微滴生成儀生成40 μL微滴，然后將微滴轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增板內(nèi)，將PCR擴(kuò)增板放入PCR儀中，運(yùn)行PCR擴(kuò)增。

擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃變性8 min，變速溫度(Ramp)2 ℃·s-1；進(jìn)行40次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(94 ℃變性30 s，Ramp 2 ℃·s-1；60 ℃退火延伸40 s，Ramp 2 ℃·s-1)；98 ℃延伸10 min，Ramp 2 ℃·s-1；4 ℃保存。

信號(hào)讀取：擴(kuò)增結(jié)束后，將PCR板放入微滴讀取儀中進(jìn)行信號(hào)讀取，并運(yùn)用QuantaSoft進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，獲得絕對(duì)定量結(jié)果。

測(cè)試樣品的轉(zhuǎn)基因品系百分含量=轉(zhuǎn)基因植物外源基因拷貝數(shù)/轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)源參考基因拷貝數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 2A-5熒光PCR檢測(cè)體系建立

根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米2A-5的外源插入序列以及自由邊界的側(cè)翼序列，共設(shè)計(jì)18個(gè)引物探針組合。針對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果，選擇重現(xiàn)性最好、靈敏度最高、擴(kuò)增條帶最亮的引物探針組合。經(jīng)過篩選，2A-5-5-QF8、2A-5-5-QR8、2A-5-5-QP8擴(kuò)增效果較為理想。

2.2 2A-5 PCR檢測(cè)方法的試驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1特異性檢測(cè) 以1%的2A-5轉(zhuǎn)基因玉米作為陽性對(duì)照，利用之前優(yōu)化好的PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序檢測(cè)其他轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、Bt176、MON810、MON863、MON87460、MON88017、MON89034、MIR162、NK603、T25、TC1507、59122、MIR604樣品和非轉(zhuǎn)基因玉米樣品。檢測(cè)結(jié)果表明，僅從2A-5轉(zhuǎn)基因玉米樣品中得到擴(kuò)增曲線，而在其他樣品中均未得到特異擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，表明建立的2A-5轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)方法具有高度特異性。

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法特異性測(cè)試Fig.1 The specificity test of real-time PCR

2.2.2靈敏度測(cè)試 設(shè)置9個(gè)2A-5 DNA含量梯度分別為500、250、50、10、2、0.4、0.08、0.025和0.005 ng·μL-1的DNA樣品，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，在含量為0.025 ng·μL-1的樣品中能擴(kuò)增到預(yù)期DNA片段(圖2A)。

2.2.3檢出限的確定 選定0.025 ng·μL-1DNA含量進(jìn)行檢出限測(cè)試，50次反應(yīng)全部出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(圖2B)，平均Ct值為36.3。因此可以確定實(shí)時(shí)熒光PCR方法的絕對(duì)檢出限為樣品DNA含量0.025 ng·μL-1，相對(duì)檢出限為0.05%。

圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法靈敏度測(cè)試和檢出限測(cè)試Fig.2 The sensitivity test and detection limit test of real-time PCR

2.3 2A-5定量PCR檢測(cè)方法的建立

2.3.1實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè) 將轉(zhuǎn)基因玉米2A-5基因組提取液與非轉(zhuǎn)基因玉米基因組提取液按一定倍數(shù)稀釋成為以下轉(zhuǎn)基因含量的DNA溶液：100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.05%、0.01%，作為qRT-PCR定量檢測(cè)的試驗(yàn)樣品。

本試驗(yàn)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率相近，擴(kuò)增效率良好，2A-5外源基因及內(nèi)源參考基因的擴(kuò)增效率分別為91.4%和94.3%，誤差值在可接受范圍之內(nèi)，回歸方程的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上，說明試驗(yàn)建立的qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)源參考基因與外源基因擴(kuò)增效率較高，完全適合用作2A-5外源基因和內(nèi)源參考基因zSSⅡb定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

A： 2A-5的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=28.587-3.547X，相關(guān)系數(shù)=0.995，效率=91.4%，誤差值=0.025；B：zSSⅡb的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=29.471-3.467X，相關(guān)系數(shù)=0.996，效率=94.3%，誤差值=0.034。

由擴(kuò)增曲線及2A-5目標(biāo)基因相對(duì)含量公式得出qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分含量見表2。該結(jié)果表明qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分含量與2A-5樣品轉(zhuǎn)基因成分含量呈高度正相關(guān)，能反映出樣品中轉(zhuǎn)基因分子的含量水平。

表2 qRT-PCR試驗(yàn)檢測(cè)2A-5轉(zhuǎn)基因成分含量Table2 The content of transgenic components of 2A-5 gene detected by qRT-PCR

2.3.2微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè) 將qRT-PCR定量檢測(cè)的試驗(yàn)樣品稀釋10倍作為ddPCR檢測(cè)的DNA樣品(ddPCR要求DNA含量不超過10 ng·μL-1)。ddPCR的關(guān)鍵步驟是微滴生成，只有微滴數(shù)大于10 000時(shí)，DNA分子的分布才符合泊松分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，系統(tǒng)才能對(duì)陽性和陰性微滴進(jìn)行計(jì)數(shù)。本試驗(yàn)中反應(yīng)中形成的微滴數(shù)均大于10 000，滿足ddPCR微滴的分析要求，結(jié)果見表3。PCR反應(yīng)模板量與測(cè)定樣品拷貝數(shù)之間相關(guān)系數(shù)達(dá)到97.5%，呈顯著正相關(guān)。該結(jié)果表明微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法能得到擴(kuò)增的含轉(zhuǎn)基因成分的最低百分含量為0.05%，檢測(cè)底限平均達(dá)4個(gè)陽性拷貝數(shù)，且能較好的反映樣品中轉(zhuǎn)基因分子的含量水平，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。

表3 ddPCR試驗(yàn)檢測(cè)2A-5轉(zhuǎn)基因成分含量Table3 The content of transgenic components of 2A-5 gene detected by ddPCR

3 討論

對(duì)跨玉米自身基因和外源基因的序列區(qū)域進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)，不僅可以達(dá)到品系鑒定的目的，并且在對(duì)含有多組分加工產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，也可以確定所檢出的外源基因是否來自于玉米，從而達(dá)到品系和品種同時(shí)鑒定的目的[11]。本研究研發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米2A-5特異性熒光定量PCR檢測(cè)方法篩選出最佳引物探針組合2A-5-5-QF8、2A-5-5-QR8、A-5-5-QP8,擴(kuò)增結(jié)果顯示出特異性強(qiáng)、靈敏度高和重復(fù)性好等特點(diǎn)，初步建立了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米2A-5轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR方法。

目前全球已有多個(gè)國家和地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品制定了相關(guān)的法律和法規(guī)，要求對(duì)其實(shí)行標(biāo)識(shí)管理。例如歐盟、巴西分別規(guī)定轉(zhuǎn)基因成分超過0.9%、1%時(shí)必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)；日本規(guī)定對(duì)大豆或玉米制成的食品如豆腐、玉米小食品等必須含有轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)，其標(biāo)識(shí)閾值設(shè)定為5%；我國實(shí)行的標(biāo)識(shí)管理政策為定性按目錄強(qiáng)制的標(biāo)識(shí)制度，即凡是列入目錄的產(chǎn)品，只要含有轉(zhuǎn)基因成分或者是由轉(zhuǎn)基因作物加工而成的產(chǎn)品必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)[12]。標(biāo)識(shí)制度不斷發(fā)展和完善促使轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法從定性檢測(cè)到定量檢測(cè)推進(jìn)，快速、靈敏、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品檢測(cè)方法研究的重點(diǎn)，是安全管理和標(biāo)識(shí)法規(guī)實(shí)施過程中的技術(shù)支撐[13]。

目前在轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)過程中，以核酸為模板基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)qRT-PCR與ddPCR等成為定量轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的首選技術(shù)，本文研究了這兩種技術(shù)在2A-5定量檢測(cè)中的應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過在PCR過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)累積的變化，從而推斷出模板的初始量，根據(jù)不同梯度含量的樣品可繪制出熒光擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在定量PCR檢測(cè)中，理想的擴(kuò)增效率為100%，然而在實(shí)際檢測(cè)中由于探針的設(shè)計(jì)、所用試劑和儀器不同、操作手法等原因限制，PCR很難實(shí)現(xiàn)100%的擴(kuò)增效率，通常擴(kuò)增效率在90%～110%之間，回歸系數(shù)在0.99以上，便可獲得較為可靠的定量結(jié)果[5]。本研究中利用qRT-PCR技術(shù)繪制出了2A-5轉(zhuǎn)化體特異序列及內(nèi)源參考基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出2A-5轉(zhuǎn)化體特異序列及zSSⅡb基因的初始模板拷貝數(shù)及2A-5轉(zhuǎn)化體的百分含量，與預(yù)混樣品2A-5轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)基因含量比較，相關(guān)性達(dá)到0.99以上，達(dá)到極顯著水平，能夠較好的反映樣品中轉(zhuǎn)基因分子的含量水平。

ddPCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用的引物和探針相同，可以對(duì)樣品做絕對(duì)定量分析?；谖⒌问綌?shù)字PCR平臺(tái)，潘廣等[14]建立了一種同時(shí)測(cè)定樣品同一個(gè)微滴反應(yīng)體系中兩種靶序列的雙重微滴式數(shù)字PCR的定量方法，對(duì)該方法的靈敏度研究表明，當(dāng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤25%時(shí)，利用該方法建立的T25雙重?cái)?shù)字PCR方法可檢測(cè)到4.6個(gè)拷貝的T25特異性邊界序列，當(dāng)不考慮相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)可檢測(cè)到該邊界序列分子的1個(gè)拷貝。本研究中通過ddPCR方法能得到擴(kuò)增的含轉(zhuǎn)基因成分的最低百分含量為0.05%，檢測(cè)底限達(dá)平均4個(gè)陽性拷貝數(shù)，可以滿足國際上對(duì)轉(zhuǎn)基因食品1%檢測(cè)底限的要求，檢測(cè)準(zhǔn)確度和靈敏度均相對(duì)較高。

目前，被歐盟等國際組織認(rèn)可的轉(zhuǎn)基因成分定量分析方法是以Taqman探針為主的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，但是熒光定量PCR技術(shù)是一種相對(duì)定量方法，需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，且建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程中涉及體系的摸索和優(yōu)化以保證擴(kuò)增效率符合要求，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定量的結(jié)果易受影響[15]。相對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，利用ddPCR進(jìn)行定量檢測(cè)PCR不依賴于Ct值，不受擴(kuò)增效率影響，檢測(cè)速度快，穩(wěn)定性、靈敏度和精確性高[16]。ddPCR技術(shù)減少了實(shí)際檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響等問題，降低了基體效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了PCR擴(kuò)增的樣品分離，消除了本底信號(hào)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響，提高了低拷貝DNA的擴(kuò)增靈敏度[17-18]。

本研究研發(fā)的引物和探針組合可以準(zhǔn)確鑒定出利用2A-5以及作為親本轉(zhuǎn)育出的衍生品種，同時(shí)利用qRT-PCR、ddPCR方法建立了2A-5的定量檢測(cè)方法，本研究建立的該玉米品系定量方法特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，靈敏度、精確性以及準(zhǔn)確性高，既適用于我國轉(zhuǎn)基因生物安全管理，又可以進(jìn)一步對(duì)我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系進(jìn)行完善。