杜夢潭, 張偉業(yè), 劉興健, 李軼女, 張志芳, 胡小元

中國農業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081

雞傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的，于1957年在美國的甘布羅地區(qū)首次被發(fā)現。20世紀80年代，IBDV超強毒株首先在英國東安格利亞爆發(fā)[1]，隨后迅速在全世界不同地區(qū)和國家蔓延。IBD使全球的家禽養(yǎng)殖業(yè)受到了重大損失，是危害家禽健康的三大傳染病之一[2]。IBDV無囊膜包裹，屬于雙RNA病毒科中的禽雙RNA病毒屬[3]，易感染3～6周齡的雛雞，使雞的免疫器官產生嚴重的損傷，最終死于免疫抑制。IBDV的基因組是由A和B兩條雙鏈RNA和核衣殼兩部分組成[4]，編碼5種結構蛋白[3]，即VP1、VP2、VP3、VP4和VP5。其中，VP2作為IBDV的主要保護性抗原，能夠使機體產生中和性抗體，多用于研制亞單位疫苗。VP2蛋白由441個氨基酸構成，形成基底結構域、凸起結構域和殼體結構域的三聚體，構成其衣殼。其中，凸起結構域的氨基酸多變，其余兩種比較保守，由可變區(qū)構成的凸起結構域有兩個疏水基團，正是這兩個疏水基團的存在使得IBDV的構象具有高度疏水性，與病毒毒性相關[5-6]。近年來，研究人員非常重視研制基因工程疫苗和DNA疫苗，為更有效地防控IBD帶來了希望。國內外研究人員利用多種表達系統(tǒng)，對IBDV的多聚蛋白和VP2等衣殼蛋白進行了亞單位疫苗的研制。

鐵蛋白(ferritin protein, Fe)首次發(fā)現于馬體內，并分離自脾臟組織，接著又發(fā)現于各種動植物和微生物體內[7-11]。自然合成的鐵蛋白多呈現空心的球形納米籠狀結構，其外徑12 nm、內徑8 nm，其球形結構由一個內核和外殼組成，內核主要是礦物質成分，外殼由24個相同的每3個鐵蛋白亞基構成的三聚體亞單位組裝形成[12-13]。鐵蛋白用作納米載體時，可以在籠狀結構內部包裹目標分子，實現緩釋或靶向釋放的功能，也可以在籠狀結構外表面固定目標分子，實現穩(wěn)定結構和抗原暴露等功能?？乖鞍走B接到鐵蛋白單體亞基的N端進行融合表達，這樣目標抗原蛋白就會錨定在自組裝鐵蛋白納米籠的外表面，且由于鐵蛋白亞基獨特的組裝方式，使得其對于天然構象為三聚體的抗原表達優(yōu)勢顯著，隨著鐵蛋白單體亞基自組裝成為三聚體，N端融合表達的抗原空間位置很近，易于形成天然三聚體結構，這樣的三聚體最大程度地還原了抗原蛋白的天然構象，同時又比較穩(wěn)定，免疫原性較單獨表達會有大幅增強。并且鐵蛋白由于其穩(wěn)定性而耐受高溫和多種變性劑，不影響其天然結構[14-15]。將納米顆粒作為免疫原載體一直是研究的熱點，鐵蛋白的單體亞基可以組裝成穩(wěn)定的多聚體，已被應用于很多疾病的免疫原載體[16-18]。目前，市場上多用減毒活疫苗對疾病進行控制，包括天然減毒株和基因重組弱毒株，其缺陷在于有回復毒力的風險，并可能激活機體潛伏的病毒，引起相應的并發(fā)癥等副作用，而鐵蛋白納米粒子由24個亞基自組裝而成，可以制備安全、高效且廉價的亞單位疫苗，是一個較為理想的抗原呈遞和疫苗開發(fā)平臺。

本研究將結合IBDV-VP2的免疫原性和鐵蛋白納米顆粒的自組裝特性，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中制備IBDV-VP2的鐵蛋白納米顆粒，并對IBDV-VP2-Fe的表達和自組裝情況進行驗證，以期為探究鐵蛋白自組裝對提高IBDV疫苗的免疫保護廣譜性、高效性的作用提供支持，也為進一步研究其作為藥物和抗原載體的應用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株：BL21(DE3)、DH5α由本實驗室保存。

DNA聚合酶、DNA marker購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；T4 DNA連接酶和抗His鼠源單克隆抗體購自北京全式金生物技術有限公司；質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；限制性內切酶、SDS-Marker購自Thermo Scientific公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG購自Beyotome公司；層析分離介質Ni預裝柱購自北京康為世紀生物科技有限公司；IPTG購自北京索萊寶科技有限公司；透析袋購自Millipore公司；其他試劑均為國產分析純。

包涵體蛋白純化所用試劑：裂解緩沖液(pH 8.0)：50 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.0)，0.2 mol·L-1NaCl，調pH至8.0；包涵體洗滌液Ⅰ(pH 8.0)：20 mmol·L-1Tris-HCl，0.2 mol·L-1NaCl，1%TritonX-100(體積分數比)，調pH至8.0。包涵體洗滌液Ⅱ(pH 8.0)：20 mmol·L-1Tris，0.2 mol·L-1NaCl，2 mol·L-1尿素調 pH 8.0。NTA-0 Buffer (pH 8.0)：20 mmol·L-1Tris，0.2 mol·L-1NaCl，5%甘油(體積分數比)，8 mol·L-1尿素調 pH 8.0。NTA-500 Buffer (pH 8.0)：20 mmol·L-1Tris，0.2 mol·L-1NaCl，5%甘油(體積分數比)，8 mol·L-1尿素，500 mmol·L-1咪唑調 pH至8.0。其他咪唑濃度的洗液 NTA-0 Buffer 和 NTA-500 Buffer 按一定比例混合。

1.2 目的片段的擴增

我們分析了近些年流行的24條IBDV毒株的多聚蛋白序列，包括8株超強毒株(GenBank登錄號為JF907702.1、X92760、AY444873.3、AF322444.1、ABI52866.1、JQ403646.1、JF907703.1、AF092943.1)、8株變異毒株(GenBank 登錄號為 D00867.1、EF418033.1、AY368653.1、JQ411012.1、AF321055.1、AF051837.1、EU595671.1、EU595672.1)、5 株經典毒株(GenBank 登錄號為 D00869、X16107、X84034、D00499、AY319768.2) 和3株疫苗毒株 (GenBank登錄號為 DQ906921.1、DQ403248.1、AF499929.1)，得到了流行強毒株病毒多聚蛋白的同感序列，Fe蛋白序列選用幽門螺旋桿菌來源(GenBank登錄號為WP_000949190.1)，送至南京金斯瑞生物科技有限公司根據大腸桿菌密碼子偏好性，對兩條序列進行優(yōu)化，合成了IBDV多聚蛋白基因序列和Fe蛋白的基因序列，插入pUC57-simple載體中，形成pUCS-IBDV-VP2/4/3和pUC57-Fe，分別以此為模板，設計特異性引物，擴增大小分別為1 362 bp的IBDV-VP2和504bp的Fe的核苷酸片段，在引物的上下游分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位點，以F1和R1(表1)作為上下游引物進行PCR擴增，擴增大小為1 362 bp的IBDV-VP2的目的片段；再分別以F2、R2和F3、R3(表1)作為上下游引物，利用融合PCR擴增大小為1 866 bp的IBDV-VP2-Fe的片段，具體步驟為首先分別以F2和R2、F3和R3為上下游引物進行PCR的擴增，之后通過核酸凝膠電泳進行膠回收，將回收的兩條目的片段混合后作為模板，以F2和R3為引物進行Overlap PCR，得到的目的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收后即得IBDV-VP2-Fe的融合片段。

表1 本研究所用引物列表Table1 List of primers used in this research

1.3 原核表達載體的構建及誘導表達

將pET28a質粒載體和上述膠回收目的片段用BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內切酶進行雙酶切，酶切后產物純化，將IBDV-VP2和IBDV-VP2-Fe目的片段和線性化后的載體以2∶1的比例配置10 μL連接體系，在 25℃連接3 h。

連接反應完成之后，吸取以上連接產物全部加入100 μL從-80℃保存條件下取出并迅速升溫至0℃左右的DH5α感受態(tài)細胞中，冰上放置30 min后，轉移至42℃水浴鍋中熱激，精確計時90 s，冰上放置2 min降溫后，加入1 mL 新鮮配置的LB培養(yǎng)基，在37℃搖床中震蕩培養(yǎng)1 h以復蘇菌體，隨后取200 μL在含卡那霉素抗性的平板培養(yǎng)基上涂布，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h左右，待有肉眼可見的單菌落后取出。

在上述平板中挑取單克隆菌株至新鮮配置的LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，提取質粒后以pET28a載體的上下游引物進行測序，將測序正確無突變的質粒，分別命名為pET28a-IBDV-VP2和pET28a-IBDV-VP2-Fe，分別轉化BL21表達菌株。用接種環(huán)從中挑取7個單克隆菌株接種至含 LB液體培養(yǎng)基的試管中過夜培養(yǎng)，此時，該含菌液的培養(yǎng)基OD600約為0.6，之后以1%的體積比例轉接，在37 ℃搖床中培養(yǎng)4 h，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG，在37℃搖床中誘導培養(yǎng)4 h，收集菌體，進行超聲破碎，4℃ 12 000 r·min-1離心5 min以分離上清液和沉淀，分別在等量的上清和沉淀中加入適量的SDS-PAGE Loading Buffer，100℃水浴10 min，4℃ 12 000 r·min-1離心10 min后，分別取上清進行SDS-PAGE鑒定表達結果，其中，IBDV-VP2蛋白和IBDV-VP2-Fe融合蛋白的理論分子量大小分別為48 kD和68 kD，挑選表達量最高的菌株以便于保存，并鑒定蛋白的表達位置，若為可溶性蛋白，則目的蛋白存在于細胞上清液中，若為包涵體表達，則存在于細胞沉淀中。

1.4 陽性克隆菌的搖瓶發(fā)酵及IBDV-VP2和IBDV-VP2-Fe蛋白的純化

將上述保存的菌種劃線，挑取單克隆至液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，然后以1%的比例接種至200 mL的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 h后，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG，于37 ℃誘導4 h。

收集菌體，加入裂解液，并利用超聲破碎5次之后，通過離心分離出沉淀，分別利用包涵體洗滌液Ⅰ、包涵體洗滌液Ⅱ對其進行洗滌，隨后，通過鎳柱進行純化，分別用咪唑濃度為25、50、100、250和500 mmol·L-1的NTA-脲進行洗脫，通過SDS-PAGE進行鑒定，選擇洗脫效果最好的咪唑濃度，進行大量地純化。

1.5 通過質譜進行鑒定

將純化后的IBDV-VP2-Fe蛋白樣品經過SDS-PAGE后，通過考馬斯亮藍染色，將其目的條帶處的聚丙烯酰胺凝膠用消毒的刀片切下來，送至上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司，通過胰酶降解、肽段除鹽，揮干后用Easy-nLC1200超高效液相串聯Q Exactive-HF高分辨質譜儀組成的液質聯用系統(tǒng)進行質譜和色譜操作，隨后利用ProteomeDiscover2.4軟件通過物種理論數據庫進行數據檢索，對凝膠中的蛋白質樣品進行鑒定。

1.6 通過Western blotting進行鑒定

將純化后的IBDV-VP2和IBDV-VP2-Fe蛋白經SDS-PAGE、再經過轉膜轉移至硝酸纖維素膜上，用抗His的鼠源單克隆抗體為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗，進行抗原-抗體反應，經DAB顯色后，在凝膠成像儀中顯示目的條帶，拍照保存。

1.7 融合蛋白納米結構電鏡觀察

將表達的蛋白沉淀采用緩沖液重懸，采用3 500 Da的透析袋以50 mmol·L-1Tris-HCl透析3次，每6 h換一次透析液，用0.45 μm濾膜過濾。接著將復性后的融合蛋白進行電鏡觀察，首先將普通濾紙剪成2 cm×3 cm大小備用，對碳膜銅網做親水處理后，將過濾后的樣品滴在銅網上，1 min后用濾紙吸走銅網上的樣品液滴，用ddH2O滴洗載樣品的銅網后，在銅網上滴加醋酸雙氧鈾進行負染，孵育1 min，隨后吸走液滴狀的醋酸雙氧鈾，待銅網晾干后，將銅網擱置在TEM菱形樣品盒中待觀察。接著使用透射電鏡儀在100 nm比例尺下拍攝IBDV-VP2-Fe、IBDV-VP2蛋白和作為陰性對照的pET28a空載表達的蛋白質的負染結構成像，成像經過了至少3次獨立的平行觀測且每次均在5個以上的區(qū)域進行觀察。

2 結果與分析

2.1 pET28a-IBDV-VP2和pET28a-IBDV-VP2-Fe原核表達載體的構建

構建原核表達載體時，分別通過PCR擴增得到目的片段，長度大小為1 362、504 bp的IBDV-VP2和Fe,將該產物進行Overlap PCR，得到了總長約為1 866 bp的IBDV-VP2-Fe，將上述片段連接至pET28a載體上，轉化克隆菌株后涂布于抗生素篩選平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),進行下一步的純化，挑取單菌落，提取質粒進行測序，測序結果顯示，與預期完全相符，即pET28a-IBDV-VP2和pET28a-IBDV-VP2-Fe。

2.2 融合蛋白誘導表達及表達形式

實驗表明，該大腸桿菌BL21表達菌株在37 ℃下用IPTG誘導表達4 h后，經過超聲破碎處理后離心進行分離，取上清和沉淀分別進行SDS-PAGE，如圖1、2所示，分別在目的蛋白大小的位置，約48、68 kD處出現明顯的條帶，這與預期一致，該結果表明目的蛋白在沉淀中含量更高，多以包涵體的形式存在，之后將IBDV-VP2-Fe蛋白通過鎳柱親和層析進行純化，SDS-PAGE結果顯示， NTA250、NTA500(咪唑濃度為250 mmol·L-1、500 mmol·L-1的NTA-脲)洗脫的純化產物在68 kD處有較明顯的蛋白條帶出現，如圖3所示，其中NTA250(用咪唑濃度是250 mmol·L-1的NTA-脲洗脫)的目的蛋白含有的雜蛋白量更少，如圖3中NTA250所示，表明其可用于目的蛋白的進一步純化。

圖1 IBDV-VP2-Fe蛋白的原核表達Fig.1 Prokaryotic expression of IBDV-VP2-Fe

圖2 IBDV-VP2蛋白的原核表達Fig.2 Prokaryotic expression of IBDV-VP2

注：M—蛋白marker。NTA0～NTA500—IBDV-VP2-Fe蛋白在不同濃度咪唑洗脫樣品。

2.4 Western blotting鑒定結果

2.3 質譜鑒定結果

純化的IBDV-VP2-Fe蛋白樣品經SDS-PAGE后，將蛋白膠上的目的條帶切下來，進行質譜鑒定，樣品總離子流圖如圖4所示，質譜結果顯示，肽段匹配到二級圖譜的數目為391，特異肽段數為42，且蛋白分子量和等電點與預測值相符，Sequset程序打分達到916.8，可信度較高，因此質譜分析結果表明該條帶為IBDV-VP2-Fe蛋白。

圖4 IBDV-VP2-Fe融合蛋白的總離子流圖Fig.4 Total ion current diagram of IBDV-VP2-Fe fusion protein

將IBDV-VP2、IBDV-VP2-Fe的蛋白經過SDS-PAGE后，轉膜后進行抗原抗體反應，結果顯示，在48、68 kD處有明顯的條帶，與陰性對照pET-28a有明顯的差距。說明已經成功地通過大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了IBDV-VP2、IBDV-VP2-Fe的蛋白。

2.5 重組蛋白的復性及胞外自組裝

將純化得到的IBDV-VP2、IBDV-VP2-Fe蛋白產物分別進行復性和自組裝后，透射電子顯微鏡觀察，發(fā)現在IBDV-VP2-Fe蛋白質樣品中可觀察到大小均勻的納米級粒子，粒徑約長12～20 nm，這與預期的納米顆粒大小相符，而IBDV-VP2蛋白樣品和陰性對照蛋白樣品中均沒有相應大小的納米級顆粒，如圖6所示，表明通過大腸桿菌原核表達載體表達的IBDV-VP2-Fe蛋白已成功組裝。

注：M—蛋白質marker；pET-28a-IBDV—IBDV的VP2蛋白；pET-28a-IBDV-VP2-Fe—IBDV-VP2與Fe的融合蛋白；pET-28a—pET-28a的陰性對照蛋白。

注：IBDV-VP2-Fe—IBDV-VP2-Fe蛋白經變性復性后的電鏡圖；IBDV-VP2—IBDV-VP2蛋白經變形復性后的電鏡圖；CK—pET28a空載體蛋白經變性復性后的電鏡圖。

3 討論

目前，IBDV主要用疫苗進行預防，但其作為一種損傷中樞免疫器官為特征的免疫抑制病毒，且容易變異，給疫苗的研發(fā)帶來了較大的困難。在變異株和超強毒株出現之前，弱毒苗和滅活苗等傳統(tǒng)疫苗可以有效防治IBD，為了更有效和更安全的預防變異株和超強毒株，國內外研究人員利用多種表達系統(tǒng)對IBDV的多聚蛋白和VP2等衣殼蛋白開展了亞單位疫苗的研發(fā)。Azad等[19]用大腸桿菌和酵母系統(tǒng)對天然的和重組的VP2蛋白進行了表達,于漣等[20]在大腸桿菌中表達了傳染性法氏囊病病毒的VP2的cDNA，Macreadie等[21]用酵母表達的 IBDV-VP2 免疫雞體，均產生了良好的免疫保護效果。

采用IBDV-VP2蛋白與鐵蛋白亞基融合表達，相較于IBDV-VP2的化學修飾而言，大大提高了其檢測的靈敏度，并且IBDV-VP2蛋白可以隨著鐵蛋白亞基的自組裝展示于蛋白質的外表面，再者，由于鐵蛋白可以通過蛋白亞基組裝形成，人們可以通過已構建的成熟表達系統(tǒng)來大量表達重組鐵蛋白，而鐵蛋白可耐高溫這一特點使得其不僅可以通過升溫操作就能夠達到分離純化的效果，同時改變鐵蛋白溶液的pH就可以向其外殼內部填充目的藥物來實現其作為納米載體的作用[21]。2013年，美國國立衛(wèi)生研究院的疫苗研究中心將流感病毒的血凝素蛋白與來源于幽門螺旋桿菌的鐵蛋白亞基形成融合蛋白，將其免疫雪貂之后，成功地在其體內檢測到了中和抗體，作為對照，單獨使用鐵蛋白免疫并不能達到這一效果，同時發(fā)現通過這種方法形成的鐵蛋白疫苗與佐劑聯合使用可以大大提高疫苗的廣譜性和免疫原性，而且利用動物來源的鐵蛋白，在注射人體時不會產生免疫反應，將該種疫苗接種雪貂之后，對其體內的免疫相關因子進行檢測，發(fā)現機體已成功擁有自主免疫能力[23]。韓國蔚山國家科學技術研究所在研究鐵蛋白作為抗原呈遞納米平臺時，發(fā)現鐵蛋白可以將卵清蛋白的OT-1和OT-2肽段呈遞給樹突狀細胞，能夠誘導CD4+T細胞和CD8+T細胞產生更多的特異性細胞因子，成功地開發(fā)了樹突狀細胞疫苗[24]。

本研究成功利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達IBDV-VP2蛋白及其與鐵蛋白的融合蛋白，將表達的目的蛋白純化之后，通過質譜鑒定，其氨基酸序列與預期一致，且Western blotting結果顯示表達的目的蛋白處出現一條特異性條帶，而空載對照則沒有，進一步研究表明表達的目的蛋白為IBDV-VP2、IBDV-VP2-Fe蛋白，并且表達的融合蛋白通過透射電鏡可以看到大小均勻的顆粒，而單獨的IBDV-VP2蛋白則沒有，表明其融合蛋白已成功組裝。但納米自組裝的效率還有待提高，后期也將對自組裝納米粒子的免疫效果進一步驗證，改進自組裝方法，提高納米粒子自組裝的效率，本研究不僅為研究法氏囊VP2蛋白的免疫原性奠定了基礎，而且為鐵蛋白自組裝增強法氏囊病毒疫苗的免疫原性，為研制更為廣譜、高效的疫苗提供了技術支持。