魏珍珍, 曾振, 杜夢(mèng)潭, 劉興健, 張志芳, 胡小元, 李軼女, 易詠竹*

1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212003；

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

豬瘟(swine fever)，也被稱為古典豬瘟(classical swine fever，CSF)，是一種高度接觸性的傳染疾病[1]，所有豬(包括家豬和野豬)都易感[2]，嚴(yán)重危害了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。豬瘟的發(fā)病與豬瘟病毒有關(guān)[3]。豬瘟病毒的遺傳物質(zhì)為單股正鏈RNA，長(zhǎng)約12.3 kb，只含有1個(gè)開放閱讀框，編碼包括E2在內(nèi)的12種病毒蛋白[4-5]，其中，豬瘟病毒的囊膜蛋白E2是起保護(hù)作用的糖抗原，被廣泛應(yīng)用于研制新型豬瘟疫苗[6-9]。我國是世界上的養(yǎng)豬大國，近年來豬瘟的大規(guī)模爆發(fā)嚴(yán)重制約了我國養(yǎng)豬業(yè)的蓬勃發(fā)展。20世紀(jì)50年代，周泰沖團(tuán)隊(duì)選育了豬瘟兔化弱毒株的豬瘟病毒，其不僅無致病性，免疫原性也良好，這個(gè)弱毒株使得我國的養(yǎng)豬業(yè)得到了良好發(fā)展[10]。但是隨著我國進(jìn)出口貿(mào)易的不斷發(fā)展，生態(tài)環(huán)境被污染和破壞，加上病原體極易變異的特性[11]，豬瘟的防控情況變得不容樂觀。相對(duì)于傳統(tǒng)的滅活疫苗[12-13]及弱毒(減毒)豬瘟疫苗[14]，蛋白源性亞單位疫苗的免疫效果和安全性更好，不會(huì)出現(xiàn)滅活不當(dāng)、毒力返強(qiáng)等問題[15]。而且在研究中，豬瘟病毒囊膜蛋白E2亞單位疫苗可利用大腸桿菌操作簡(jiǎn)易、表達(dá)量高、培養(yǎng)成本低、生產(chǎn)時(shí)效短等優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行大規(guī)模高純度的制備[16-17]。

近年來，隨著交叉學(xué)科的快速發(fā)展，生物學(xué)與納米材料技術(shù)的交叉滲透正在快速發(fā)展。其中，鐵蛋白自組裝納米顆粒技術(shù)引起人們的關(guān)注，鐵蛋白可自發(fā)組裝形成均一、穩(wěn)定、具有良好生物相容性的蛋白顆粒[18]，經(jīng)過基因工程改造后，有些鐵蛋白制成的納米材料對(duì)機(jī)體無害，可作為機(jī)體病灶檢測(cè)平臺(tái)[19-21]、靶向藥物載體[22]、藥物緩釋劑[23]、疫苗[24]等發(fā)揮潛在的作用。鐵蛋白納米顆粒的優(yōu)勢(shì)也較為突出，直徑僅約12 nm，是空心籠狀且結(jié)構(gòu)高度對(duì)稱的八面體納米顆粒，鐵蛋白的性質(zhì)非常穩(wěn)定，能耐受70～80 ℃的高溫而不變性。但是鐵蛋白的組裝受pH調(diào)控，在酸性條件下(pH 2.0)鐵蛋白外殼會(huì)解體成亞基，當(dāng)pH回升至生理?xiàng)l件時(shí)(pH 7.4)，各亞基又重新組裝構(gòu)成完整的鐵蛋白[25-26]。鐵蛋白球形中空結(jié)構(gòu)有3個(gè)接口：內(nèi)表面、外表面及亞基間接觸面，亞基間接觸面可通過調(diào)節(jié)溶液pH完成解聚與重組，開發(fā)鐵蛋白的新功能?，F(xiàn)已能夠成功構(gòu)建大腸桿菌的鐵蛋白表達(dá)體系，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，可得鐵蛋白納米顆粒，通過復(fù)性等也可獲得天然空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而作為抗原呈遞載體和疫苗開發(fā)平臺(tái)。研究表明，利用大腸桿菌表達(dá)的人重組鐵蛋白納米顆粒制成的生物技術(shù)藥物[27]，對(duì)機(jī)體的毒性大大降低，使得其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[22,28-30]。

為了獲得具有強(qiáng)抗原性的新型豬瘟亞單位疫苗，本研究以豬瘟病毒囊膜蛋白E2基因及納米顆粒載體鐵蛋白基因?yàn)椴牧?，?gòu)建融合基因E2-Fe，將其克隆到pET28a載體上后，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件對(duì)其進(jìn)行高效表達(dá)，再將表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行鎳柱純化、質(zhì)譜分析、Western-blotting驗(yàn)證及電鏡檢測(cè)，以期獲得高效表達(dá)的融合鐵蛋白的豬瘟病毒囊膜蛋白E2，為開發(fā)豬瘟新型疫苗擴(kuò)寬研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coilBL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ及EcoRⅠ、T4 DNA連接酶購于美國Promega公司；卡那霉素購于美國Sigma公司；Fast pfu高保真酶、DNA Marker、His-tag一抗購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；酵母提取物及蛋白胨購于德國AppliChem公司；PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購于美國Invitrogen公司；研究所用試劑均為分析純。

Gel Doc XR+凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；DK-8D電熱恒溫水浴槽(上海一恒科技有限公司)；DYY-6D核酸電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；Tecnai G2 F20電鏡(美國FEI公司)。

1.2 融合基因E2-Fe的構(gòu)建

從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索本研究所需的豬瘟病毒囊膜蛋白E2基因序列，比對(duì)后選擇GenBank序列號(hào)為ART84247.1所示的氨基酸序列作為豬瘟病毒囊膜蛋白E2的原始氨基酸序列，通過SignalP-4.1和TMHMM對(duì)豬瘟病毒囊膜蛋白E2基因序列進(jìn)行分析，本研究截取了其具有抗原免疫原性的胞外域作為豬瘟病毒囊膜蛋白E2的亞單位疫苗來源，基因序列長(zhǎng)度為738 bp，同時(shí)使用OptimumGeneTM方法，優(yōu)化E2蛋白基因的密碼子適應(yīng)能力指數(shù)(codon adaptation index)，再利用密碼子的簡(jiǎn)并性，除去稀有密碼子，且在轉(zhuǎn)錄時(shí)不會(huì)生成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并通過軟件找到其限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，根據(jù)研究需要去除原始序列中一部分酶切位點(diǎn)；從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索本研究所需的鐵蛋白基因序列，對(duì)比后選擇GenBank號(hào)為WP_000949190所示的鐵蛋白氨基酸序列作為原始氨基酸序列，同時(shí)為了保持結(jié)構(gòu)均一性，消除序列上潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)(N19Q)，為了使豬瘟病毒囊膜蛋白E2和鐵蛋白可以融合表達(dá)，去掉鐵蛋白的前4個(gè)氨基酸，換成SGG作為linker，最終基因序列長(zhǎng)度為501 bp。設(shè)計(jì)引物時(shí)，在兩側(cè)添加不同的常見酶切位點(diǎn)，交至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司化學(xué)合成。

利用重疊PCR進(jìn)行融合基因E2-Fe的構(gòu)建，所用引物序列見表1。分別以E2囊膜蛋白的胞外域、鐵蛋白Fe為模板，以E2-F/R、Fe-F/R為引物，進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(共50 μL)為：模板DNA 3 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，dNTPs 3 μL，10×buffer 10 μL，ddH2O 31 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共29個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR完成后，利用玻璃奶法分別回收2條目的片段。再以2條目的片段為模板，以E2-F、Fe-R為引物，進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(共50 μL)為：2條目的片段各3 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，dNTPs 3 μL，10×buffer 10 μL，ddH2O 28 μL。反應(yīng)程序同第1輪PCR。利用玻璃奶法回收PCR產(chǎn)物，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 本研究所用引物Table1 Primers used in this study

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-E2-Fe及基因工程菌的構(gòu)建與篩選

本研究選取了2個(gè)常用的酶切位點(diǎn)BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ，分別對(duì)重疊PCR終產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，在瓊脂糖凝膠電泳中鑒定重組體系，用玻璃奶法回收，保存于-20 ℃?zhèn)溆?；pET28a空載質(zhì)粒體系于65 ℃水浴中滅活15 min，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將重疊PCR終產(chǎn)物的雙酶切產(chǎn)物連接到同樣雙酶切后的pET28a空載質(zhì)粒上，構(gòu)建表達(dá)載體，采用堿裂解法提取pET28a-E2-Fe質(zhì)粒[31]。將通過初篩鑒定獲得的重組質(zhì)粒由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，選擇有正確測(cè)序結(jié)果的pET28a-E2-Fe重組質(zhì)粒，而后在E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，構(gòu)建基因工程菌株。

1.4 融合蛋白E2-Fe在大腸桿菌中的表達(dá)及純化

挑取1.3中構(gòu)建的單菌落于4.5 mL的含卡那霉素50 mg·mL-1的2YT液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)，當(dāng)其OD值約為0.7時(shí)，加入適量的IPTG或者一水合乳糖(0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%)誘導(dǎo)6 h，以期獲得高表達(dá)條件。目的蛋白大小預(yù)測(cè)為51 kD左右，收集菌液后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析，將菌液重懸于450 μL pH 8.0的裂解緩沖液，進(jìn)行超聲破碎，離心后留取沉淀用脲NTA-0重懸后溶解過夜，在鎳柱中用脲NTA-25洗脫，收集目的蛋白。

1.5 質(zhì)譜分析與Western-blotting驗(yàn)證

將1.4純化的目的融合蛋白的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，將目的條帶切下交由上海歐易生物公司使用Easy-nLC 1200液相系統(tǒng)、高pH分離液相色譜儀等進(jìn)行了質(zhì)譜驗(yàn)證。

將1.4純化的目的融合蛋白的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后將硝酸纖維素膜封閉在PBS配制的3%BSA中，于4 ℃過夜，用PBS-T洗去表面封閉液，洗3次。隨后加入His-tag一抗室溫?fù)u床上孵育1.5 h，用PBS-T洗去表面抗體，洗3次，再在室溫?fù)u床上用HRP標(biāo)記的鼠抗山羊IgG孵育2 h后，同樣用PBS-T洗去表面抗體，洗滌3次。最后用增強(qiáng)型ECL顯色液進(jìn)行顯色拍照。

1.6 透析與超濾復(fù)性及電鏡觀察

將裁剪成適當(dāng)長(zhǎng)度(約15 cm)的3.5 kD透析袋，在1 L的1 mmol·L-1pH 8.0的EDTA和2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaOH溶液中煮沸10 min，在蒸餾水中進(jìn)行徹底洗滌后，再在1 mmol·L-1pH 8.0的EDTA溶液中煮沸10 min。再次用蒸餾水進(jìn)行洗滌后，將1.4中經(jīng)鎳柱純化后的目的蛋白加入透析袋中，分別使用8、6、4、2、1及0 mol·L-1濃度的尿素溶液進(jìn)行透析，每4 h更換1次梯度尿素溶液。

取1 mL上述復(fù)性后樣品加入有2/3體積的30%蔗糖溶液離心管中，補(bǔ)加PBS來配平離心管，在111 000 r·min-1的離心力下，超速離心1.5 h，對(duì)樣品進(jìn)行再次純化。后續(xù)根據(jù)需要，使用50 K的超濾管對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步純化和濃縮。

將超離純化后的樣品點(diǎn)滴在親水處理過的碳膜銅網(wǎng)上，1 min后用提前預(yù)備好的2 cm×3 cm大小的普通濾紙吸去樣品，隨后用ddH2O滴洗1次載有樣品的銅網(wǎng)，用裁剪成小扇形的濾紙尖角小心地吸去銅網(wǎng)上的水滴。最后滴加醋酸雙氧鈾負(fù)染樣品1 min，吸去后，等待銅網(wǎng)晾干后，放置于TEM菱形樣品盒中并在電鏡中進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-E2-Fe的構(gòu)建

為了確認(rèn)融合基因E2-Fe已成功克隆到pET28a載體上，本研究了采用雙酶切法來進(jìn)行鑒定，重疊PCR終產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切所釋放的片段如圖1所示，E2-Fe片段長(zhǎng)度約為1 200 bp，PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物長(zhǎng)度與理論預(yù)測(cè)結(jié)果一致。將上述PCR終產(chǎn)物回收后重組到同樣雙酶切后的pET28a空載質(zhì)粒上。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a-E2-Fe保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

注：M—DNA Marker；1—E2-FePCR擴(kuò)增片段。

2.2 E2-Fe融合蛋白在E.coliBL21中的誘導(dǎo)表達(dá)及其條件優(yōu)化

在誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白E2-Fe前使用在線軟件ExPASy預(yù)測(cè)了其分子量約為51 kD。為了使融合蛋白得到高效表達(dá)，本研究首先使用了IPTG來誘導(dǎo)E.coli表達(dá)融合蛋白，通過改變IPTG的用量、培養(yǎng)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白在菌液上清及沉淀中的表達(dá)量都依然較低，且沒有發(fā)生明顯改變,繼而使用乳糖作為誘導(dǎo)物。研究結(jié)果(圖2)表明，使用0.5%乳糖誘導(dǎo)6 h時(shí)，菌液沉淀中融合蛋白的表達(dá)量幾乎到了高峰，而其他濃度的乳糖誘導(dǎo)6 h時(shí)菌液上清的蛋白膠圖中均未觀察到明顯的目的條帶。這說明在本研究中，乳糖是比IPTG更適合的誘導(dǎo)物，融合蛋白E2-Fe以包涵體形式存在于菌液沉淀中，誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件為：0.5%乳糖誘導(dǎo)6 h。

圖2 不同濃度乳糖誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白E2-Fe膠圖Fig.2 Gel map of fusion protein E2-Fe induced by lactose at different concentrations

2.3 E2-Fe融合蛋白的質(zhì)譜分析與Western-blotting驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述目的條帶確為融合蛋白E2-Fe，而后進(jìn)行了質(zhì)譜分析與Western-blotting驗(yàn)證。將目的條帶切下后進(jìn)行了質(zhì)譜分析，結(jié)果如表2所示，對(duì)蛋白匹配度的打分為9.16，蛋白的分子量及氨基酸數(shù)目也與預(yù)測(cè)值基本相符，其中分子量大小的微小差異可能與使用的蛋白預(yù)測(cè)軟件不同有關(guān)，因此質(zhì)譜分析結(jié)果表明此條帶確為E2-Fe融合蛋白。Western-blotting驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示，在51 kD附近出現(xiàn)了明顯的條帶，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符，其他部位出現(xiàn)的不明顯條帶可能與His-tag一抗與蛋白的結(jié)合力較強(qiáng)有關(guān)。上述所有結(jié)果都已表明本研究成功在E.coliBL21中高效表達(dá)了E2-Fe融合蛋白。

表2 E2-Fe融合蛋白相應(yīng)氨基酸片段質(zhì)譜分析結(jié)果Table2 Mass spectrometric analysis results of corresponding amino acid fragments of E2-Fe fusion protein

圖3 E2-Fe融合蛋白的Western-blotting圖Fig.3 Western-blotting of E2-Fe fusion protein

2.4 E2-Fe融合蛋白的電鏡觀察

鐵蛋白納米顆粒的直徑約為12 nm。為了驗(yàn)證融合蛋白E2-Fe是否以納米顆粒的形式存在于菌液沉淀中，將獲得的菌液沉淀超聲破碎后充分溶解于脲NTA-0溶液中，使用鎳柱純化后透析復(fù)性，將獲得的融合蛋白E2-Fe在111 000 r·min-1的離心力下，超速離心1.5 h，放于-80 ℃進(jìn)行保存留用以待進(jìn)行電鏡觀察。圖4為融合蛋白E2-Fe的透射電鏡觀察圖，重復(fù)試驗(yàn)即圖4A、4B、4C中均可見大小較為均一、直徑約為20 nm的顆粒。此結(jié)果表明，融合蛋白E2-Fe是以納米顆粒的形式存在于菌液沉淀中的。

圖4 透射電鏡結(jié)果圖Fig.4 Transmission electron microscopy results

3 討論

對(duì)于傳統(tǒng)的滅活豬瘟疫苗來說，其免疫期短、保護(hù)力低[32]，我國豬瘟兔化弱毒株疫苗雖然使得我國的養(yǎng)豬業(yè)得到了進(jìn)一步發(fā)展[33]，但是，近幾年豬瘟不僅發(fā)病率明顯增高，其流行趨勢(shì)和流行特點(diǎn)也越發(fā)復(fù)雜，持續(xù)感染的情況在全世界普遍存在，對(duì)其防控遇到了新的瓶頸期。同時(shí)我國又是養(yǎng)豬大國，近年來豬瘟的大爆發(fā)使得我國的養(yǎng)豬業(yè)陷入低迷期，豬肉也大幅漲價(jià)，所以加快豬瘟疫苗的研制刻不容緩。

2013年，美國國家衛(wèi)生研究所與過敏與傳染病研究所將鐵蛋白應(yīng)用于流感疫苗的研發(fā)，將幽門螺桿菌鐵蛋白亞基的N端與流感病毒的H血凝素蛋白(hemagglutinin)基因融合，將該融合蛋白納米顆粒作為抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)，在動(dòng)物體內(nèi)成功的發(fā)生了免疫反應(yīng)，生產(chǎn)了中和性抗體，達(dá)到了流感病毒疫苗的作用，而且這種新型疫苗的免疫范圍更廣，產(chǎn)生的中和抗體滴度比傳統(tǒng)疫苗要高10倍左右，且能中和絕大多數(shù)跨度達(dá)70年的同型流行病毒株[34]。研究表明蛋白源性亞單位疫苗可以很好地解決傳統(tǒng)滅活疫苗、弱毒(減毒)疫苗存在的問題。豬瘟病毒囊膜蛋白E2不僅具有較高的保守性，還可以在機(jī)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)發(fā)生，生成中和抗體，是主要的保護(hù)性抗原蛋白；而1個(gè)鐵蛋白納米顆粒表面可展示24個(gè)抗原蛋白，其免疫原性有可能會(huì)得到進(jìn)一步提高，是理想的抗原呈遞載體和疫苗開發(fā)平臺(tái)。本研究以豬瘟病毒囊膜蛋白E2和鐵蛋白納米顆粒為材料，經(jīng)過基因工程改造后，在E.coliBL21中成功地表達(dá)了融合蛋白E2-Fe，該融合蛋白是以納米顆粒形式存在于菌液沉淀中的。經(jīng)本研究發(fā)現(xiàn)，在融合蛋白表達(dá)過程中，0.5%乳糖誘導(dǎo)6 h可使其高效表達(dá)。從SDS-PAGE、Western-blotting結(jié)果圖以及電鏡圖中均可看出，蛋白表達(dá)量較為可觀，其純化方法也比較簡(jiǎn)單。上述結(jié)果表明，以鐵蛋白納米顆粒為載體在大腸桿菌中高效表達(dá)豬瘟病毒囊膜蛋白E2來作為新型豬瘟疫苗是有可行性的。

但是大腸桿菌作為原核表達(dá)系統(tǒng)，在表達(dá)外源蛋白時(shí)會(huì)缺乏復(fù)雜的磷酸化、糖基化以及形成復(fù)雜二硫鍵等的翻譯后修飾過程，對(duì)外源蛋白的正確折疊以及生物活性存在一定影響。從本研究結(jié)果也可看出融合蛋白E2-Fe是以包涵體的形式存在于菌液沉淀中的，因此在進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)前需要進(jìn)行蛋白復(fù)性實(shí)驗(yàn)，增加了后期的實(shí)驗(yàn)量，針對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)，可通過繼續(xù)優(yōu)化條件，如mRNA模板、培養(yǎng)基的成分及種類、培養(yǎng)條件、以及培養(yǎng)方式等，而使大腸桿菌更高效地表達(dá)外源目的蛋白，以期獲得具有自然空間構(gòu)象的融合蛋白E2-Fe，早日達(dá)到疫苗生產(chǎn)的條件，加快新型豬瘟疫苗的研發(fā)進(jìn)程。