嚴(yán)雪瑜，葉香塵，韋玲靜，文衍紅，楊著山，滕忠作，劉 康，呂業(yè)堅(jiān)

( 1.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)引育種中心，廣西 南寧 530031； 2.柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 柳州 545006； 3.柳州市融水苗族自治縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 柳州 545300 )

魚類作為一種水生動(dòng)物，其自身體內(nèi)及所生存的環(huán)境中都存在著大量的不同種類的微生物[1]。魚類腸道作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的場(chǎng)所，其內(nèi)部的微生物受到宿主腸道環(huán)境及本身遺傳特征等因素的影響，從而定殖成為腸道固有菌群[2]，形成了一個(gè)腸道微生物與宿主以及所處的水生環(huán)境相互制約、相互依賴的微生態(tài)系統(tǒng)[3]。穩(wěn)定性良好的腸道微生物環(huán)境對(duì)于魚類的消化、吸收、代謝、免疫調(diào)節(jié)和疾病防控等具有重要意義[4]。然而，魚類腸道的微生物變化是動(dòng)態(tài)的，其群落組成受到宿主種類、生長(zhǎng)發(fā)育、餌料組成和環(huán)境因素等影響[5-7]。因此，通過分析魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)上存在的差異及組成特點(diǎn)，可以獲得更有利于魚類生長(zhǎng)健康的腸道微生物信息[8]。

我國(guó)稻田養(yǎng)魚歷史悠久，在養(yǎng)殖過程中，稻田里的雜草、浮萍以及浮游生物可為魚類提供充分且營(yíng)養(yǎng)豐富的餌料，這種養(yǎng)殖方式在保證魚類生長(zhǎng)和健康的同時(shí)還可改善水質(zhì)以及水稻的生長(zhǎng)條件，在一定程度上節(jié)約了養(yǎng)殖成本，實(shí)現(xiàn)資源的可持續(xù)利用[9]。因此，針對(duì)稻田養(yǎng)殖開發(fā)適宜的魚類養(yǎng)殖品種十分必要。金邊鯉(Cyprinuscarpiovar.jinbian，暫定名)因其背鰭兩側(cè)各有一條金黃色的“金邊”而得名，是由廣西水產(chǎn)引育種中心聯(lián)合多個(gè)單位針對(duì)稻田養(yǎng)殖而選育開發(fā)的鯉魚新品系[10]。金邊鯉作為一個(gè)正在培育中的新品種，其遺傳基礎(chǔ)、生理特征及生活習(xí)性仍需進(jìn)一步研究，了解其在稻田養(yǎng)殖模式下的生長(zhǎng)適應(yīng)情況，查明不同養(yǎng)殖模式對(duì)金邊鯉腸道微生物的影響，對(duì)進(jìn)一步探究金邊鯉的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制具有十分重要的意義。因此，筆者擬通過對(duì)池塘和稻田的養(yǎng)殖模式下金邊鯉和建鯉(C.carpiovar.jian)進(jìn)行腸道宏基因組測(cè)序，分析不同鯉魚的腸道菌群差異以及不同養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)鯉魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，探討和評(píng)估金邊鯉在稻田養(yǎng)殖模式中的生長(zhǎng)和適應(yīng)情況，為金邊鯉下一步的選育工作提供研究方向和理論依據(jù)，為完善和推廣金邊鯉的稻田養(yǎng)殖模式提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用魚以及試驗(yàn)場(chǎng)地均由廣西融水縣融榮水產(chǎn)繁殖場(chǎng)提供。試驗(yàn)魚分別在水池中暫養(yǎng)7 d后隨機(jī)挑選規(guī)格整齊、體質(zhì)健壯的魚各200尾，金邊鯉體質(zhì)量(15.7±2.0) g，體長(zhǎng)(8.2±0.4) cm，建鯉體質(zhì)量(13.2±2.3) g，體長(zhǎng)(7.8±0.5) cm，分別在金邊鯉和建鯉的眼瞼處注射紅色和綠色熒光標(biāo)記后將2種鯉魚平均分為2組，分別同塘(同稻田)混養(yǎng)90 d。池塘養(yǎng)殖密度為45 000尾/hm2，稻田養(yǎng)殖密度為6000尾/hm2。試驗(yàn)期間，池塘養(yǎng)殖日投喂人工配合飼料2次(8:30和18:00)，日投喂量為魚體質(zhì)量的2%;稻田養(yǎng)殖不投飼料。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后試驗(yàn)魚停食24 h，根據(jù)熒光標(biāo)記分別從稻田和池塘中采集金邊鯉和建鯉各15尾，標(biāo)記為池塘金邊鯉組(B1)、稻田金邊鯉組(B2)、池塘建鯉組(N1)和稻田建鯉組(N2)；其中每組隨機(jī)分成3個(gè)平行組，每個(gè)平行5尾魚。按照無菌操作對(duì)樣品進(jìn)行處理，用無菌生理鹽水沖洗腸管外壁，用2 mL凍存管收集腸道內(nèi)容物樣品后立即放入液氮中，隨后置于冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆?。腸道內(nèi)容物樣品用干冰保存送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行宏基因組文庫構(gòu)建和測(cè)序。

1.3 宏基因組高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

將每個(gè)平行組的腸道內(nèi)容物樣品混合為一個(gè)樣品，分別對(duì)每組樣品進(jìn)行MiSeq宏基因組PE文庫構(gòu)建和Illumina測(cè)序。將相似度大于0.97的序列歸為1個(gè)運(yùn)算分類單元(OTU)，統(tǒng)計(jì)各樣品所含運(yùn)算分類單元的數(shù)量，去除無法分類的運(yùn)算分類單元后進(jìn)行運(yùn)算分類單元聚類分析和物種分類學(xué)分析，計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)中的豐富度(Chao、Ace)、多樣性(Simpson、Shannon)和覆蓋率，在生物學(xué)分類的門水平和屬水平進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度分析，將標(biāo)準(zhǔn)化的操作分類單元比對(duì)京都基因和基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行群落功能分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)每個(gè)平行組的α-多樣性指數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)檢驗(yàn)，運(yùn)用單因素方差分析和Duncan′s多重比較對(duì)4組樣品的α-多樣性指數(shù)和菌群結(jié)構(gòu)組成數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異比較和顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA基因高通量測(cè)序結(jié)果分析

池塘金邊鯉組、稻田金邊鯉組、池塘建鯉組、稻田建鯉組分別產(chǎn)生377、250、367和455個(gè)運(yùn)算分類單元，其中4組樣品共有的運(yùn)算分類單元數(shù)量為175個(gè)，而每組特有的運(yùn)算分類單元數(shù)量分別為39、1、15和53個(gè)。此外，金邊鯉的池塘組和稻田組產(chǎn)生的共有運(yùn)算分類單元數(shù)量為201個(gè)，建鯉的池塘組和稻田組共有的運(yùn)算分類單元數(shù)量為335個(gè)；而池塘養(yǎng)殖的金邊鯉和建鯉共有運(yùn)算分類單元數(shù)量為282個(gè)，稻田養(yǎng)殖金邊鯉和建鯉的共有運(yùn)算分類單元數(shù)量為240個(gè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，池塘建鯉和稻田建鯉的相同運(yùn)算分類單元數(shù)量最多，而稻田金邊鯉和稻田建鯉也共享了較多相同的運(yùn)算分類單元(圖1)。

圖1 各組樣品運(yùn)算分類單元數(shù)量比較分析

2.2 菌群多樣性分析

在97%水平上對(duì)所有樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析，池塘金邊鯉組的Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均高于稻田金邊鯉組，表明池塘金邊鯉的腸道菌群群落豐富度高于稻田金邊鯉；而稻田建鯉組的Ace指數(shù)和Chao指數(shù)高于池塘建鯉組，表明稻田建鯉的腸道菌群群落豐富度高于其池塘組。稻田金邊鯉組的香農(nóng)指數(shù)高于池塘金邊鯉組，稻田建鯉組的香農(nóng)指數(shù)亦高于池塘建鯉組，表明稻田養(yǎng)殖的金邊鯉及建鯉的腸道菌群群落多樣性均高于對(duì)應(yīng)的池塘組；而辛普森指數(shù)結(jié)果與香農(nóng)指數(shù)的結(jié)果相反，提示池塘組群落多樣性的均勻度較好。4組樣品的覆蓋率指數(shù)均達(dá)0.998以上，表明測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種(表1)。

表1 各組樣品的α-多樣性指數(shù)(n=3)

2.3 各組樣品群落組成分析

2.3.1 樣品優(yōu)勢(shì)操作分類單元豐度差異分析

選取所有樣品中前50的優(yōu)勢(shì)豐度操作分類單元進(jìn)行差異比較分析，結(jié)果見圖2。不同養(yǎng)殖方式組間比較發(fā)現(xiàn)，建鯉的池塘組和稻田組之間的顏色相似度明顯低于金邊鯉的池塘組和稻田組的相似度，提示在稻田和池塘養(yǎng)殖模式下金邊鯉的腸道優(yōu)勢(shì)菌群可能較建鯉的更穩(wěn)定；而金邊鯉的池塘組和稻田組也存在顏色差異，表明在不同生長(zhǎng)環(huán)境下，金邊鯉的腸道菌群結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度各不相同。此外，同一養(yǎng)殖方式的組間比較發(fā)現(xiàn)，池塘養(yǎng)殖的金邊鯉和建鯉之間的顏色差異小于稻田養(yǎng)殖金邊鯉和建鯉之間的差異，提示池塘養(yǎng)殖模式下金邊鯉和建鯉的腸道優(yōu)勢(shì)菌群相似性最高。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同種類及不同生長(zhǎng)環(huán)境均會(huì)對(duì)鯉魚的腸道菌群產(chǎn)生一定的影響。

圖2 各組樣品優(yōu)勢(shì)操作分類單元豐度熱圖

2.3.2 樣品菌群結(jié)構(gòu)組成差異分析

在生物學(xué)分類門水平中，4組的優(yōu)勢(shì)菌門主要包括變形菌門、梭桿菌門、厚壁菌門、藍(lán)細(xì)菌門、放線菌門、綠彎菌門和柔膜菌門。其中，池塘金邊鯉組中最主要的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門，占總數(shù)的89.56%，顯著高于其他菌門(P<0.05)；其他3組的優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門、梭桿菌門和厚壁菌門，但細(xì)菌豐度比例存在一定的差異(圖3)。

圖3 各組樣品生物分類學(xué)門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度

在生物學(xué)分類屬水平中，池塘金邊鯉組的第一優(yōu)勢(shì)菌屬為氣單胞菌屬(82.68%)，顯著高于其他菌屬(P<0.05)；而稻田金邊鯉組的主要優(yōu)勢(shì)菌屬包括氣單胞菌屬(Aeromonas)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、克雷伯菌屬(Kkbsiella)和腸桿菌屬(Enterobacter)，比例分別為32.43%、32.37%、12.79%、8.36%和6.14%，5種優(yōu)勢(shì)菌屬差異不顯著(P>0.05)；池塘建鯉組的前3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬為鯨桿菌屬(35.72%)、氣單胞菌屬(27.94%)和乳球菌屬(12.29%)，3種菌屬差異不顯著(P>0.05)；稻田建鯉組中除去未分類和未分級(jí)的菌屬，主要優(yōu)勢(shì)菌屬為鯨桿菌屬(26.83%)、氣單胞菌屬(25.16%)和乳球菌屬(8.50%)，幾種優(yōu)勢(shì)菌屬間差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

圖4 各組樣品生物分類學(xué)屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度

2.4 腸道微生物16SrRNA基因功能預(yù)測(cè)分析

基于各組樣品的操作分類單元豐度水平進(jìn)行腸道微生物16S rRNA基因功能預(yù)測(cè)，比對(duì)獲得了229個(gè)信號(hào)通路，分別選取每組樣品的前50個(gè)信號(hào)通路進(jìn)行比較分析，其維恩圖見圖5。由圖5可見，各組樣品的腸道微生物操作分類單元共富集到45個(gè)相同的信號(hào)通路。各組樣品共有的信號(hào)通路見圖6，通過圖6可以看到其腸道微生物主要為多種物質(zhì)的代謝途徑，包括丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、組氨酸、脂肪酸、乙醛酸、二羧酸、丙酮酸、丙酸、丁酸、煙酸、煙酰胺、甲烷、果糖、甘露糖、淀粉、蔗糖、氨基糖、核苷酸糖、甘油磷脂、卟啉、葉綠素、嘌呤、嘧啶和氮代謝，還有賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、肽聚糖、脂肪酸、葉酸、泛酸、CoA和?；?tRNA等生物合成途徑，以及光合生物中的碳固定、原核生物中的碳固定、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑、氧化磷酸化、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)輸出、核糖體、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解等代謝通路，表明魚類腸道微生物的主要功能是參與各類物質(zhì)的代謝；此外，還富集到了細(xì)菌趨化性、鞭毛組裝、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、雙組分系統(tǒng)、同源重組和錯(cuò)配修復(fù)等信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)和修復(fù)機(jī)制途徑，提示魚類腸道微生物可能具有一定的免疫和修復(fù)調(diào)節(jié)等功能。此外，不同養(yǎng)殖模式組間比較發(fā)現(xiàn)，池塘組和稻田組建鯉的腸道微生物參與的信號(hào)通路基本一致，而池塘組和稻田組金邊鯉的腸道微生物參與的信號(hào)通路存在一定的差異，其中池塘金邊鯉組特異富集到了谷胱甘肽代謝、色氨酸代謝、β-丙氨酸代謝以及泛醌和其他萜類化合物—醌生物合成等通路，提示不同生長(zhǎng)環(huán)境會(huì)對(duì)金邊鯉的腸道微生物的功能產(chǎn)生一定的影響。

圖6 各組樣品共有信號(hào)通路比較分析

3 討 論

3.1 不同生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

在正常的生長(zhǎng)環(huán)境下，生物體內(nèi)的大多數(shù)微生物在調(diào)節(jié)機(jī)體的各種生命功能方面起著積極的作用[11]。大量水產(chǎn)養(yǎng)殖研究表明，由于水生動(dòng)物生活環(huán)境的特殊性，養(yǎng)殖模式、池塘水質(zhì)、飼料類型等環(huán)境影響因素以及發(fā)育階段、腸道結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)水平和系統(tǒng)發(fā)育地位等變化均可打破微生物與生物之間的平衡，從而影響水生動(dòng)物消化道中微生物的種類和數(shù)量[12-14]。研究證實(shí)，微生物環(huán)境可以通過水環(huán)境、飼料等引起草魚(Ctenopharyngodonidellus)腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[15-16]。此外，同一養(yǎng)殖環(huán)境下的不同魚類，其腸道微生物群落的組成還可能會(huì)受到食性、棲息地和基因型的影響[17-19]。孟曉林等[20]發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度的銅可影響鯉魚腸道菌群的多樣性和結(jié)構(gòu)組成，并對(duì)鯉魚腸道上皮免疫屏障造成損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)環(huán)境下的金邊鯉和建鯉腸道菌群均存在一定的差異，提示養(yǎng)殖環(huán)境會(huì)對(duì)鯉魚的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的影響。該結(jié)果與李建柱[21]的研究結(jié)果基本一致，即在魚菜共生模式下，草魚、鯽魚(Carassiusauratus)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)和鳙魚(Aristichthysnobilis)等4種不同的鯉科魚類腸道微生物的菌落組成和優(yōu)勢(shì)菌落具有一定的相似性，但是與其他養(yǎng)殖模式中魚類的腸道微生物菌落卻具有差異性[21]。大量研究證實(shí)，魚類的腸道菌群受多種因素的影響，但這些因素的獨(dú)立或協(xié)同作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.2 不同品種鯉魚腸道微生物優(yōu)勢(shì)菌群比較分析

大量研究表明，梭桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形桿菌門是脊椎動(dòng)物腸道的核心菌群，其中變形菌門是魚類腸道微生物中最主要的優(yōu)勢(shì)菌群之一[22]，而擬桿菌屬(Bacteroides)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)和梭桿菌屬(Fusobacterium)中的專性厭氧菌是淡水魚的腸道優(yōu)勢(shì)內(nèi)源性菌群的主要種類[23]。王琴等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在池塘中主養(yǎng)草魚混養(yǎng)不同比例鰱魚、鳙魚、鯽魚和匙吻鱘(Polyodonspathula)的3種混養(yǎng)模式下，草魚腸道菌群相似性較高，主要菌群包括變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門和厚壁菌門等。李建柱[21]則發(fā)現(xiàn)，草魚、鯽魚、鰱魚和鳙魚4種鯉科魚類腸道微生物的主要優(yōu)勢(shì)菌門包括梭桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門，優(yōu)勢(shì)菌屬包括鯨桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、擬桿菌屬和芽孢桿菌屬等。王蕾[25]發(fā)現(xiàn)，變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門、厚壁菌門和放線菌門等細(xì)菌門類存在于胚胎期、仔稚魚期和幼魚期的鯉魚樣本中；而混養(yǎng)池塘中6月齡的鯉魚腸道菌群中含量較高的菌門為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、柔膜菌門和梭桿菌門，優(yōu)勢(shì)菌屬為氣單胞菌屬和乳球菌屬，鯽魚和草魚腸道菌群種類與鯉魚相似，但優(yōu)勢(shì)菌和組成比例具有一定的差異。而黃進(jìn)強(qiáng)等[26]發(fā)現(xiàn)，鹽堿塘養(yǎng)殖鯉魚腸道細(xì)菌歸屬于變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和梭桿菌門，弧菌科中的氣單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。本研究發(fā)現(xiàn)，金邊鯉和建鯉的主要腸道微生物均歸屬為變形菌門、梭桿菌門、厚壁菌門和藍(lán)細(xì)菌門等，主要優(yōu)勢(shì)菌屬包括氣單胞菌屬、鯨桿菌屬和乳球菌屬等，且品種間無顯著差異，與其他鯉科魚類的研究結(jié)果基本一致。

3.3 金邊鯉腸道微生物優(yōu)勢(shì)菌群作用分析

池塘金邊鯉組的優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門和氣單胞菌屬，占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；而另外3組在門分類水平和屬分類水平的菌群結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度較為相似，優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門、梭桿菌門和厚壁菌門，主要優(yōu)勢(shì)菌屬為鯨桿菌屬、氣單胞菌屬和乳球菌屬。其中乳球菌屬是水生動(dòng)物的一類重要腸道益生菌，對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)具有重要作用，可以增強(qiáng)宿主免疫力，其在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌素和乳酸，抑制某些病原細(xì)菌的生長(zhǎng)，抵抗病原菌入侵腸道[27]。而鯨桿菌屬具有發(fā)酵多肽碳水化合物的能力，并且可以產(chǎn)生維生素B12[28]，在魚類的消化和營(yíng)養(yǎng)過程中起到重要的作用。而在正常情況下，氣單胞菌在健康魚類的腸道中是有益的[14]，該細(xì)菌可以通過阻止病原菌在腸道和養(yǎng)殖環(huán)境中過多繁殖，從而改善水體環(huán)境和提高宿主的免疫力[29]，因此，魚類腸道中氣單胞菌為優(yōu)勢(shì)菌種可能也是適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境的一種表現(xiàn)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，與池塘組相比，金邊鯉在稻田養(yǎng)殖模式下的腸道菌群結(jié)構(gòu)更為豐富，并且與相同養(yǎng)殖條件下的建鯉無顯著差異，其優(yōu)勢(shì)菌群在正常情況下基本屬于有益菌群，提示金邊鯉可以很好地適應(yīng)稻田和池塘養(yǎng)殖環(huán)境。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過比較分析稻田和池塘兩種養(yǎng)殖模式下的金邊鯉和建鯉腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成和豐度差異，發(fā)現(xiàn)稻田養(yǎng)殖的金邊鯉和建鯉腸道菌群多樣性高于相應(yīng)的池塘養(yǎng)殖模式，而金邊鯉的腸道優(yōu)勢(shì)菌群種類、相對(duì)豐度以及參與的信號(hào)通路與建鯉無顯著差異，提示金邊鯉與其他鯉魚一樣可適應(yīng)這兩種養(yǎng)殖模式。