吳國火,崔 林,王夢馨,李紅亮,韓寶瑜

中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室, 杭州 310018

植物揮發(fā)物在植物與昆蟲之間的信息交流過程中起著重要作用,對昆蟲的寄主植物定向行為、昆蟲產(chǎn)卵行為、寄生蜂的寄主尋找行為等產(chǎn)生影響[1]。如番茄葉揮發(fā)物對B型煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)具有行為導(dǎo)向作用[2],茶梢揮發(fā)物可引誘假眼小綠葉蟬Empoascavitis(G?the)[3],蟬害誘導(dǎo)的茶梢揮發(fā)物可引誘天敵昆蟲葉蟬三棒纓小蜂StethyniumempoascaeSubba Rao、微小裂骨纓小蜂SchizophragmaparvulaOgloblin寄生[4-5]。植物揮發(fā)物也密切影響著昆蟲的傳粉行為[6],許多植物在開花期間,由花朵釋放出多種揮發(fā)性物質(zhì),如丁香酚、苯酚等,這些揮發(fā)性化合物對傳粉昆蟲具有強烈的引誘作用,誘導(dǎo)傳粉昆蟲對蜜源做定向飛行[7]。

中華蜜蜂Apisceranacerana是我國特有的資源蜂種[8],其長期適應(yīng)我國的氣候條件,易于發(fā)現(xiàn)分散、零星開花的植物花粉,在維持生態(tài)平衡方面具有重要意義；其低溫出巢的生活習(xí)性恰適宜于高寒地區(qū)以及早春和晚秋等低溫條件下開花植物的傳粉[9]。目前,對中華蜜蜂化學(xué)通訊的研究主要集中在蜜蜂自身腺體分泌的信息素[10],如工蜂那氏腺釋放的氣味具有引導(dǎo)和定向其他工蜂的作用[11]。生活中很早就發(fā)現(xiàn)植物揮發(fā)物尤其是花香,對蜜蜂具有引誘作用[12], Liu等[13]發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂可識別植物花粉氣味中的酚類物質(zhì)含量,對低酚性物質(zhì)含量的植物花粉具有偏好性,但總體來說有關(guān)植物揮發(fā)物引誘蜜蜂的研究較少。

我國茶園面積已達(dá)300 萬hm2,約占世界茶園面積60%,因此茶樹花資源非常豐富[14]。茶樹花香氣清香略帶甜味,是秋冬季理想的蜜源。10月下旬茶樹花盛開,成群的蜜蜂涌入茶園,茶樹花展示了強大的引誘潛能。如果篩選出對蜜蜂有顯著引誘作用的茶樹花香氣組分和茶葉揮發(fā)性組分,則可更好地理解茶樹花引誘蜜蜂蜂群的機理,還能使用這些成分調(diào)控蜜蜂采集茶樹花蜜,提高訪花蜜蜂數(shù)量和訪花頻率,以便充分開發(fā)茶樹花資源,增加單位面積茶園的經(jīng)濟效益。為檢測中華蜜蜂對茶樹花香氣及茶葉氣味的行為反應(yīng),本研究選用鑒定于茶樹花和茶鮮葉的揮發(fā)性組分作為味源,用Y形嗅覺儀測定其行為反應(yīng),期望篩選出能顯著調(diào)控中華蜜蜂行為的組分,以揭示茶樹花引誘中華蜜蜂的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試?yán)ハx：實驗用中華蜜蜂取自中國計量大學(xué)蜂場,實驗前禁食0.5 h。室內(nèi)生物測定時隨機選用工蜂。

供試茶樹花味源：供試茶樹種植于中國計量大學(xué)實驗茶園(北緯30°19′29.90″,東經(jīng)120°21′19.16″,海拔11 m),樹齡皆為5年；使用8個國家級茶樹良種(表1),即‘安吉白茶’、‘中茶108’、‘茂綠’、‘龍井43’、‘烏牛早’、‘鳩坑早’、‘鐵觀音’和‘金觀音’,其在我國長江中下游地區(qū)皆有大面積種植。取其茶樹鮮花作為味源,設(shè)0.25 g、0.50 g、1.00 g、2.00 g、3.00 g、4.00 g和5.00 g 共7個劑量。以潔凈空氣為CK。

供試化合物味源：從茶樹花香氣[15-18]中選擇主要的、含量較大的27種組分(表2),選擇茶葉揮發(fā)性化合物[19-20]中比較重要的24種組分(表3),這51種化合物購自Sigma公司,純度≥98%。以液體石蠟為溶劑將每種化合物配成10-6g/mL、10-4g/mL和10-2g/mL 3 個劑量,其中苯乙酮、芳樟醇、α-法尼烯、順- 3-己烯-1-醇和吲哚配成10-10g/mL、10-8g/mL、10-6g/mL、10-4g/mL和10-2g/mL 5 個劑量進行測定。每次行為測定時,分別吸取每個劑量的1 mL溶液作為味源,以1 mL液體石蠟作為CK。

1.2 Y形嗅覺儀及測定程序

Y形管由無色透明玻璃制成,兩臂與基部長度皆為15 cm,內(nèi)徑為1.5 cm,兩臂夾角為120°。兩臂分別連接味源瓶(或?qū)φ掌?、加濕瓶、空氣過濾瓶(內(nèi)裝滿已活化的活性炭)和流量計,各部件之間以Teflon管連接[21]。測定時分別吸取 1 mL 味源于開口的安碚瓶,開口安碚瓶置于味源瓶中；再吸取液體石蠟 1 mL 于開口安碚瓶中,置開口安碚瓶于對照瓶中。用氣泵從Y形管基部管口抽氣,測定時調(diào)節(jié)每臂流量為120 mL /min。測定前先抽氣10 min,使Y形管味源臂中充滿待測氣味。測試時用試管將1頭中華蜜蜂從Y形管基部管口引入。蜜蜂進入之后,則逆風(fēng)行進,或直線爬行,或螺旋式行進,在Y形管交叉處做一個選擇,進入Y形管的一臂,爬行5 cm記為選擇該臂,超過5 min 無反應(yīng)則不計數(shù)。

51種味源的每個處理劑量分別測定20頭中華蜜蜂,每頭只用1次；每測試10頭,用無水乙醇擦洗Y形管內(nèi)外壁,烘干,調(diào)換Y形管兩臂與味源瓶和對照瓶的連接位置,用于消除Y形管可能的不對稱而造成的影響。每個劑量的味源測定結(jié)束后,將 Y 形管、味源瓶等玻璃部件用重鉻酸鉀洗液清洗,于 100℃烘箱內(nèi)烘干?；钚蕴吭?0℃烘4 h以解除其吸附的異味分子。

生物測定在暗室內(nèi)執(zhí)行,Y形管上方1.5 m處有1盞15W白熾燈提供照明。每天生物測定時間從8: 00至16: 00,這期間該蜂比較活躍。室溫25℃,相對濕度(70±3)%。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

使用 SPSS 22.0軟件完成數(shù)據(jù)分析。對中華蜜蜂進行室內(nèi) Y 形管嗅覺行為測定時,假設(shè)供試味源對于中華蜜蜂行為沒有影響,則中華蜜蜂趨向味源和CK的概率均為50%,則有假設(shè)測驗H0= 50∶50,對于該蜂趨向味源和CK的數(shù)量差異作χ2測驗,當(dāng)P<0.05 時,則差異達(dá)顯著水平,當(dāng)P<0.01 時,則差異達(dá)極顯著水平。

2 結(jié)果和分析

2.1 8個茶樹品種茶樹花氣味引誘中華蜜蜂的效應(yīng)

以8個良種茶樹的鮮花作為味源,潔凈空氣為CK,當(dāng)味源劑量從 0.25 g、0.5 g、1.0 g、2.0 g、3.0 g、4.0 g遞增至5.0 g時,‘安吉白茶’品種茶樹花對中華蜜蜂的吸引效果逐漸增強,當(dāng)味源劑量為3.0 g時引誘的蜜蜂數(shù)與CK引誘的蜜蜂數(shù)的差異達(dá)顯著水平,味源劑量再增加時其吸引力逐漸下降。隨著味源劑量的增加,‘中茶108’品種茶樹花的吸引效果也逐漸增強,當(dāng)味源劑量達(dá)到2.0 g時,其引誘效果達(dá)顯著水平,之后引誘力下降。‘茂綠’品種茶樹花對于蜜蜂的引誘效果也隨著其劑量的增加而逐漸增強,當(dāng)味源劑量達(dá)到0.5 g時,其引誘的蜂數(shù)與CK之間的差異顯著,其后吸引力下降。而‘龍井43’品種茶樹花供試劑量為0.25 g時,引誘效果與CK之間的差異顯著,其后隨著茶樹花劑量的增加,吸引效果逐漸下降,當(dāng)茶樹花劑量為4.0 g或5.0 g時,與CK相比則具有顯著的排斥效應(yīng)。‘烏牛早’、‘鳩坑早’、‘鐵觀音’和‘金觀音’品種的茶樹花劑量為0.25 g時,對中華蜜蜂引誘效應(yīng)與CK的差異顯著,隨著劑量的增加,吸引效果趨于下降,其中‘烏牛早’茶樹花劑量為5.0 g時,對供試蜜蜂還有排斥效應(yīng)(圖1)。

圖1 Y 形管嗅覺儀測定的8個品種茶樹花與潔凈空氣引誘的蜜蜂數(shù)及其差異Fig.1 Difference between number of bees choosing each of eight tea cultivar flowers and number of bees choosing fresh air during Y-tube olfactometer bioassay *茶樹花與潔凈空氣引誘蜜蜂數(shù)量之間的差異性達(dá)顯著水平

8個品種茶樹花用作味源,在低劑量時吸引供試蜜蜂,隨著劑量的增加,引誘效應(yīng)增強,到一定劑量時引誘效應(yīng)與CK引誘效應(yīng)之間的差異達(dá)顯著水平；之后,茶樹花吸引效果趨于下降。假設(shè)選擇茶樹花的中華蜜蜂數(shù)為y,供試茶樹花劑量為x,則有選擇 8個品種茶樹花的中華蜜蜂數(shù)與供試味源劑量之間的關(guān)系式(表1)。

表1 選擇8個品種茶樹花的中華蜜蜂數(shù)與供試茶樹花劑量之間的相關(guān)性

2.2 茶樹花香氣組分和茶葉揮發(fā)性組分引誘中華蜜蜂的作用

27 種茶樹花香氣組分中,苯乙酮(10-6g/mL)、芳樟醇(10-6、10-2g/mL)、莰烯(10-4g/mL)、順- 3-己烯-1-醇(10-10g/mL)、α-法尼烯(10-2g/mL)、癸醛(10-6g/mL)、β-紫羅蘭酮(10-6g/mL)、亞油酸(10-4g/mL)、順-2-戊烯-1-醇(10-4g/mL)和苯甲醛(10-2g/mL)對中華蜜蜂引誘效應(yīng)與CK(液體石蠟)誘效之間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。α-法尼烯(10-6、10-4g/mL)和亞油酸(10-2g/mL)對中華蜜蜂引誘效應(yīng)則達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。隨著供試劑量的增加,水楊酸甲酯、橙花醇對中華蜜蜂引誘力下降,在劑量為10-2g/mL時皆顯示顯著排斥作用(P<0.05),其中水楊酸甲酯達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；辛醛(10-6g/mL)也表現(xiàn)出顯著排斥作用(P<0.05) (表2)。

表2 Y形嗅覺儀檢測的茶樹花27個主要香氣組分與液體石蠟引誘中華蜜蜂數(shù)量的差異性

24個供試茶葉氣味組分中,十八醇(10-4g/mL)、正辛醇(10-2g/mL)、吲哚(10-6g/mL)、薄荷醇(10-6g/mL)、薄荷酮(10-4、10-2g/mL)對中華蜜蜂引誘效應(yīng)與CK(液體石蠟)之間差異達(dá)顯著水平(P<0.05),檸檬醛(10-2g/mL)、β-石竹烯(10-4g/mL)則達(dá)到極顯著引誘水平(P<0.01)。鄰甲苯酚(10-2g/mL)、香茅醇(10-6g/mL)、1, 3-丙二醇(10-2g/mL)、α-松油烯(10-6g/mL)、正戊醇(10-4g/mL)則表現(xiàn)出顯著排斥作用(P<0.05)(表3)。

表3 Y形嗅覺儀檢測的茶鮮葉24個重要揮發(fā)性組分與液體石蠟引誘中華蜜蜂數(shù)量的差異性

3 討論

本研究選用了8個大面積栽培的茶樹良種,以它們的鮮花為味源,檢測中發(fā)現(xiàn)低劑量鮮花引誘中華蜜蜂；隨著劑量的加大,引誘效應(yīng)增強,當(dāng)劑量達(dá)到一定閾值時茶樹花引誘效應(yīng)與潔凈空氣引誘效應(yīng)之間差異達(dá)顯著水平；之后,茶樹花劑量再增加,引誘效果則下降,個別品種茶樹花甚至顯現(xiàn)了排斥效應(yīng)；味源質(zhì)量與其引誘的蜜蜂數(shù)之間相關(guān)性顯著。本研究也還發(fā)現(xiàn)茶樹花香氣主要組分、茶鮮葉揮發(fā)物重要組分對于中華蜜蜂的引誘效應(yīng)也顯示出類似的反應(yīng)趨勢。亦即在確定空間內(nèi),隨著味源劑量的增加,供試?yán)ハx做出有規(guī)則的趨向反應(yīng)。潘鋮等[4]用Y形管嗅覺儀檢測了葉蟬三棒纓小蜂對于健康茶梢嫩莖、葉蟬口針刺吸和產(chǎn)卵管刺傷茶梢嫩莖、機械刺傷茶梢嫩莖等多種味源的多個劑量的趨向反應(yīng),皆獲得了與此類似的行為反應(yīng)。本課題組從擁有近3000份茶樹種質(zhì)的國家茶樹資源圃(杭州)挑選了在長江中下游地區(qū)和華南地區(qū)廣泛種植的23個茶樹良種,從這23個良種香花中鑒定了79個香氣組分,發(fā)現(xiàn)在每個品種鮮花中苯乙酮和芳樟醇相對含量皆分別超過鮮花香氣總含量20%[15]。苯乙酮和芳樟醇的含量不僅分別超過了茶樹花香氣總量的20%,而且二者皆顯著地吸引中華蜜蜂。成片茶園開花過程中,散發(fā)的濃烈香氣和茶鮮葉氣味招引著中華蜜蜂,尤其是其中的苯乙酮和芳樟醇等組分。這是茶樹花引誘中華蜜蜂的主要原因之一。

本研究發(fā)現(xiàn),苯乙酮和芳樟醇在10-6g/mL的低劑量便可顯著引誘中華蜜蜂。β-紫羅蘭酮、莰烯、Z- 3-己烯-1-醇、α-法尼烯、癸醛、亞油酸、Z-2-戊烯-1-醇和苯甲醛也顯著地引誘中華蜜蜂。然而,水楊酸甲酯、辛醛和橙花醇3個組分顯示了排斥效應(yīng)。本研究檢測的24個茶鮮葉揮發(fā)物中,十八醇、正辛醇、吲哚、薄荷醇、薄荷酮、檸檬醛和β-石竹烯對中華蜜蜂有顯著或極顯著引誘效應(yīng)；正戊醇、鄰甲苯酚、香茅醇、1, 3-丙二醇、α-松油烯5個組分則表現(xiàn)出顯著排斥作用。香葉醇、橙花醇對中華蜜蜂引誘作用沒有達(dá)到顯著水平；檸檬醛在10-2g/mL劑量時對中華蜜蜂有顯著吸引作用,這與已有的研究結(jié)果一致[22]。我們課題組發(fā)現(xiàn)AcerCSP3 可能作為中華蜜蜂觸角化學(xué)感受系統(tǒng)的一部分,在搜尋某些植物花粉蜜源時其作為氣味分子運載體而發(fā)揮一定的作用,其中β-紫羅蘭酮與AcerCSP3具有較強的競爭結(jié)合能力[23]。β-紫羅蘭酮和中華蜜蜂普通氣味結(jié)合蛋白AcerASP2的氣味識別力和結(jié)合力遠(yuǎn)大于水楊酸甲酯、香葉醇與AcerASP2競爭結(jié)合力[24]。β-紫羅蘭酮與中華蜜蜂化學(xué)感受蛋白CSP1也有較強結(jié)合能力,為蜜蜂偏好性氣味[25]。分析認(rèn)為,本研究中茶樹花和茶鮮葉揮發(fā)物中引誘中華蜜蜂的組分質(zhì)和量皆顯著多于排斥中華蜜蜂的組分,茶樹花香氣和茶鮮葉氣味顯著引誘中華蜜蜂。

植物揮發(fā)物是由多種低濃度的揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物組成的混合物[26-28],昆蟲行為受多種揮發(fā)物的協(xié)同影響。因此,需要將多種單一揮發(fā)性組分按其相互間自然比例配成混合物,再測其引誘效果[29- 30]。本組將選擇顯著引誘蜜蜂的組分,按不同比例配制多種備選引誘劑,結(jié)合色板等視覺引誘技術(shù)于茶園中進行誘效檢測,期望篩選出高效的中華蜜蜂引誘劑,用于蜜蜂行為的調(diào)控。