姚良雪， 韓家鑫， 魏培韻， 侯思博， 何瀟劍， 張瑞嶺,2△， 杜愛林,2△

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室， 中英腦功能損傷聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室， 河南省高校腦研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 河南省生物精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

酒精中毒在全球影響健康危險(xiǎn)因素中處于前列，在我國的發(fā)病率也逐年上升。慢性酒精中毒可以導(dǎo)致神經(jīng)損傷[1]，酒精能高效穿過血腦屏障影響與記憶相關(guān)腦區(qū)及其功能[2,3]，導(dǎo)致記憶減退、認(rèn)知障礙等表現(xiàn)。慢性酒精中毒能促進(jìn)硫化氫(H2S)的產(chǎn)生。生理濃度的H2S能發(fā)揮多種神經(jīng)調(diào)節(jié)功能，并有線粒體保護(hù)作用，但H2S濃度異常升高引起細(xì)胞損傷[4,5]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，內(nèi)源性H2S的主要催化調(diào)節(jié)酶是胱硫醚-β-合成酶(N-cyclohexylbenzothiazole-2-sulphenamide, CBS)，并且具有組織特異性。酒精中毒可使海馬等部位CBS活性增強(qiáng)，H2S水平異常升高引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷[6]。丁苯酞(N-butylphthalide, NBP)是我國自主研發(fā)的新藥物，具有多種神經(jīng)保護(hù)作用，能改善線粒體功能，減輕記憶障礙，對腦缺血等腦損傷的多個(gè)環(huán)節(jié)均有作用。丁苯酞可能降低了酒精中毒所致高濃度H2S，從而能夠?qū)β跃凭卸酒鹨欢ǖ母纳谱饔谩?/p>

本研究通過復(fù)制大鼠慢性酒精中毒模型并觀察丁苯酞作用于慢性酒精中毒大鼠后海馬及杏仁核內(nèi)H2S和CBS的含量、線粒體ATP酶活性以及大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，探究丁苯酞對慢性酒精中毒造模大鼠與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的杏仁核及海馬組織的積極影響，以了解NBP對慢性酒精中毒導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力減退的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

取清潔級健康SD雄大鼠90只，3～4周 (來自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心),體重(140±20)g。在22～25℃實(shí)驗(yàn)室中對大鼠進(jìn)行4～6 d的適應(yīng)期飼養(yǎng)，然后將大鼠隨機(jī)分成3組：正常對照組(normal control group，NC組)、丁苯酞治療組(Butylphthalide remedy group，BR組)、慢性酒精中毒模型組(Model group, M組)，每組30只。

1.2 主要儀器和試劑

超低溫冰箱由美國Thermo Forma公司生產(chǎn)；Morris水迷宮和行為學(xué)記錄軟件EthoVision XT 8購于德國Noldus公司；購自德國Eppendorf公司的微量加樣器；高速冷凍離心機(jī)(產(chǎn)自德國Heraeus公司)；Bio-TekELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；FA1004電子分析天平由上海瀘奧明科學(xué)儀器有限公司提供；DAB顯色試劑盒、鏈霉卵白素工作液、山羊抗兔IgG聚合物、封閉用正常山羊血清工作液由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；線粒體提取試劑盒、超微量總ATP酶測定試劑盒、總蛋白測定試劑盒(購于中國南京建成生物工程研究所)；丁苯酞由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司提供；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純級。

1.3 模型制作和處理

除正常對照組外，把其余組均復(fù)制成慢性酒精中毒動(dòng)物模型。造模期間控制室溫23 ～25℃，每日9：00重新配制體積分?jǐn)?shù)為6% 的酒精水溶液(大鼠自由飲水的唯一來源)并置換。14 d后，按5 mg/kg的比例將丁苯酞溶解在1 ml生理鹽水中，丁苯酞治療組每日腹腔注射一次，連續(xù)14 d。其余兩組每日腹腔注射1 ml生理鹽水。

1.4 學(xué)習(xí)記憶能力評價(jià)

用Morris水迷宮(型號(hào): RD1101-MWM-G)測試各組大鼠。實(shí)驗(yàn)前剔除游泳能力極差的大鼠。在未被剔除大鼠中每組隨機(jī)選24只進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)共5 d，訓(xùn)練4 d，第5日進(jìn)行檢測大鼠對自身形成的空間位置能力記憶的保持程度。訓(xùn)練時(shí)控制水下平臺(tái)在水下0.5 cm處，水溫22℃±2℃，所有大鼠每天每象限各訓(xùn)練1次，每次訓(xùn)練60 s。訓(xùn)練期內(nèi)用追蹤記錄大鼠游動(dòng)軌跡。若60 s內(nèi)大鼠找到水下平臺(tái)，讓其在平臺(tái)上停留30 s,來鞏固其空間記憶。如60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，通過引導(dǎo)同樣使其在平臺(tái)上停留30 s。第5日進(jìn)行空間記憶探索檢測，移除水下平臺(tái),將大鼠在原平臺(tái)所在象限的對側(cè)釋放,規(guī)定300 s游泳時(shí)長,期間記錄大鼠在原平臺(tái)所在象限跨越平臺(tái)的次數(shù)和游泳距離并計(jì)算兩者比重。

1.5 亞甲基藍(lán)分光光度法測定海馬、杏仁核中H2S的含量

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，大鼠行腹腔麻醉，斷頭取腦，取出新鮮海馬及杏仁核組織，-80℃冰箱保存， -20℃下充分研磨。采用亞甲基藍(lán)分光光度法[7]，波長670 nm處測定大鼠海馬以及杏仁核組織液的吸光度，按照H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)H2S含量。將杏仁核海馬中硫化氫的含量表示為nmol/g。

1.6 免疫組化觀察海馬、杏仁核CBS表達(dá)

再次隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，對各組實(shí)驗(yàn)大鼠取腦，實(shí)施石蠟包埋常規(guī)切片處理，經(jīng)脫蠟和水化以及抗原修復(fù)，免疫組化后，經(jīng)暗處DAB顯色，常規(guī)脫水、透明及中性樹膠封片后，于顯微鏡下觀察雙側(cè)海馬、杏仁核并攝片,用image-pro-plus 6.0圖像分析軟件分析CBS的陽性表達(dá)情況。

1.7 線粒體的提取分離及ATP 酶活力的測定

剩余8只大鼠進(jìn)行線粒體ATP酶活性測定，低溫快速取出腦海馬及杏仁核保存，嚴(yán)格遵循試劑盒說明書，提取組織經(jīng)機(jī)械破裂、差速離心獲得線粒體，經(jīng)酶促及定磷反應(yīng)處理，在636 nm波長處使用分光光度計(jì)測定吸光度值，依照相關(guān)公式來算出線粒體ATP酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 丁苯酞對各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

如表1、2所示，與正常對照組相比，模型組大鼠學(xué)習(xí)與記憶的能力明顯下降，表現(xiàn)為潛伏期和游泳距離的增多，第1至4日有極顯著性差異(P< 0.01)；給予NBP處理后，相比模型組，治療組大鼠潛伏期和游泳距離明顯減少，第2至4日有極顯著性差異(P<0.01)。

Tab. 1 Latency period of rats in each group in place navigation test(s， n= 8)

Tab. 2 Swimming distance of rats in each group in place navigation test(cm， n=8)

2.2 丁苯酞對各組大鼠海馬、杏仁核組織中H2S的含量變化的影響

如表3所示，模型組大鼠與正常對照組相比，模型組海馬、杏仁核組織內(nèi)的H2S含量明顯增高，有極顯著性差異(P<0.01)；和模型組比較，NBP干預(yù)組大鼠海馬、杏仁核組織中H2S含量均降低，有極顯著性差異(P<0.01)。

Tab. 3 Mean content of H2S in hippocampus and amygdala tissue of rats in each group(nmol /g， n=8)

2.3 丁苯酞對各組大鼠海馬、杏仁核組織中CBS表達(dá)的影響

如圖1、圖2所示，光鏡下各組大鼠海馬、杏仁核均可見一定量CBS陽性表達(dá)。如表4所示，各組大鼠海馬、杏仁核均可見一定量CBS表達(dá)。與正常組相比，模型組CBS含量明顯升高，有極顯著性差異(P<0.01)；和模型組大鼠相比，NBP治療干預(yù)組CBS含量降低，有極顯著性差異(P<0.01)。

Tab. 4 Mean average optical density of CBS in hippocampal and amygdala tissue of rats in each group (OD， n=8)

2.4 丁苯酞對各組大鼠海馬、杏仁核線粒體ATP酶活性的影響

如表5所示，和對照組相比，模型組大鼠海馬組織、杏仁核線粒體ATP酶活性明顯降低，有極顯著性差異(P<0.01)；和模型組大鼠相比，治療組大鼠給予NBP處理后，海馬組織、杏仁核線粒體ATP酶活性上升，有極顯著性差異(P<0.01)。

Fig. 1 Hippocampus of rats (× 400)

Fig. 2 Amygdala of rats (× 400)

Tab. 5 Mitochondrial ATPase activity in hippocampus and amygdala tissue of rats in each group(μmolPi/mg prot·hour， n=8)

3 討論

慢性酒精中毒在全球不同程度地危害著人類健康。慢性酒精中毒可以引起神經(jīng)系統(tǒng)損害，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降以及精神行為功能的缺陷。在我國，慢性酒精中毒已成為不可忽視的社會(huì)公共衛(wèi)生問題。

海馬、杏仁核同屬邊緣系統(tǒng)，兩者互相調(diào)節(jié)，功能聯(lián)系密切[8]，是學(xué)習(xí)記憶經(jīng)典神經(jīng)環(huán)路的重要組成部分[9,10]，共同參與包括情感發(fā)生和學(xué)習(xí)記憶保存在內(nèi)的多種過程[11]。海馬對記憶信息進(jìn)行中樞整合，是學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知調(diào)節(jié)等功能的關(guān)鍵腦區(qū)[12]。 杏仁核可調(diào)節(jié)情感學(xué)習(xí)及記憶能力[13.14]，在情緒調(diào)控及記憶中的作用不可或缺。

Morris水迷宮用來研究空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)功能[15,16]。本實(shí)驗(yàn)將大鼠暴露在水迷宮中，通過測定游泳距離、潛伏期等指標(biāo)，測試空白大鼠、酒精中毒大鼠和NBP治療干預(yù)組大鼠空間探索記憶能力[17]。結(jié)果顯示，酒精中毒大鼠較對照組游泳距離和潛伏期延長，丁苯酞干預(yù)組在Morris水迷宮中的表現(xiàn)均改善。提示丁苯酞對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力減退有干預(yù)作用。

H2S是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的信號(hào)分子，起神經(jīng)保護(hù)作用[18,19]，胱硫醚-β-合酶(CBS)是神經(jīng)系統(tǒng)H2S合成中的關(guān)鍵限速酶，該酶在神經(jīng)系統(tǒng)特別是海馬和杏仁核區(qū)中大量表達(dá)。CBS/H2S體系的維持與海馬相關(guān)學(xué)習(xí)記憶能力有顯著相關(guān)性[4]。

外源性H2S可增強(qiáng)海馬、杏仁核內(nèi)N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDAR)依賴性的LTP,調(diào)節(jié)海馬依賴的場景型記憶和新物認(rèn)知能力，并抑制記憶的遺忘[20,21]。線索恐懼訓(xùn)練后大鼠腦組織的H2S含量增加，但過高水平的H2S對神經(jīng)元有毒害作用，H2S發(fā)揮作用可因位置及含量不同而不同[22]。慢性酒精中毒可通過Ca2+超載引起鈣調(diào)素活性提高以及激活NMDAR等途徑激活CBS導(dǎo)致H2S合成過量，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用[23，24]。丁苯酞可以抑制CBS活性，減少H2S的生成[6]。實(shí)驗(yàn)測得慢性酒精中毒大鼠大腦海馬、杏仁核CBS的表達(dá)以及H2S的生成都明顯高于對照組，而丁苯酞組水平可見明顯改善。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化以及合成ATP的主要場所。ATP酶催化合成ATP,在能量代謝方面十分重要。高濃度H2S可通過抑制細(xì)胞色素C氧化以及引起線粒體鈣超載造成線粒體能量代謝障礙，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)通過測定大鼠海馬、杏仁核線粒體 ATP 酶活性發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬、杏仁核內(nèi)的線粒體ATP酶活性較正常組偏低，丁苯酞治療組ATP酶活性較模型組有所提高，表明丁苯酞可有效改善慢性酒精中毒大鼠海馬、杏仁核組織內(nèi)線粒體的能量代謝障礙程度。

綜上所述，丁苯酞減輕慢性酒精中毒對大鼠海馬、杏仁核相關(guān)腦區(qū)結(jié)構(gòu)功能的損害，可能是通過抑制因慢性酒精中毒引起的H2S/CBS系統(tǒng)的過度表達(dá)，改善能量供應(yīng)和信息傳遞能力，提高慢性酒精中毒大鼠的學(xué)習(xí)記憶水平。