α-荼異硫氰酸酯誘導(dǎo)小鼠膽汁淤積性肝纖維化及其炎癥通路*

羅怡爽， 鄭秀婷， 章浩月， 徐麗萍， 裘加鵬， 徐港銘， 劉愛明

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 浙江 寧波 315211)

肝纖維化的特征是由于慢性肝病導(dǎo)致肝組織反復(fù)受損從而引起細胞外基質(zhì)蛋白的大量沉積[1]。酒精濫用、肝炎病毒感染、遺傳異常、脂肪性肝炎、自身免疫和其他慢性肝病都能引起肝纖維化。肝纖維化不能得到及時治療，容易發(fā)展成為肝硬化、肝衰竭、肝癌等惡性疾病[2, 3]。有文獻報道，在美國每年有30 000人的死因是肝纖維化，并且在肝癌患者中，80%～90%患有肝纖維化[4]。

膽汁淤積性肝病是膽汁代謝穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁酸水平升高，反流入血，并引起的一系列器質(zhì)性損害，常導(dǎo)致肝硬化和肝功能衰竭[5]。原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)和原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是兩種典型的膽汁淤積性肝病[6]。中國南方的PBC患病率為492例/百萬，英國北部的PBC患病率為200～251例/百萬[7, 8]。此外，患有非酒精性脂肪性肝病的患者也會發(fā)生膽汁淤積，亞洲國家的發(fā)病率超過40%[9]。膽汁淤積性肝纖維化是肝纖維化中的一類疾病，膽汁淤積發(fā)生導(dǎo)致肝細胞受損后，相鄰的成體肝細胞能夠再生并代替凋亡和壞死細胞[10]。而受損肝細胞再生失敗時將被細胞外基質(zhì)蛋白代替，并伴隨炎癥的發(fā)生。細胞外基質(zhì)組分從膠原蛋白IV，VI和糖蛋白，蛋白多糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟z原蛋白I，III和纖連蛋白[11, 12]。

膽汁淤積性肝病的發(fā)病后果嚴(yán)重，慢性膽汁淤積性肝病模型涉及較少，而且炎癥機制尚不明確。本次實驗中，小鼠由0.05%-荼異硫氰酸酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT)飲食誘導(dǎo)產(chǎn)生慢性膽汁淤積，研究膽汁淤積性肝纖維化發(fā)生發(fā)展及所涉及的炎癥通路，為研究膽汁淤積性肝纖維化發(fā)生機制和尋找藥物治療靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

15只體重為(23±2)g的6～8周齡SPF級129/Sv雄性小鼠，購自南京模式動物中心。實驗前，在寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。外部環(huán)境保持在(23±1)°C的溫度，50%～60%的濕度和12 h的正常光暗循環(huán)。動物研究方案及操作流程經(jīng)寧波大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑

ANIT(Sigma，美國)；玉米油(上海阿拉丁試劑公司)；Trizol(Omega，美國)；RT 試劑和Q-PCR 試劑(北京康為世紀(jì)生物科技公司)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)、總膽汁酸(total bile acid，TBA，寧波瑞源生物科技有限公司)；天狼星紅染液(上海源葉生物科技有限公司)；Collagen I 抗體 (SAB，美國)；α-SMA，t-JNK，p-JNK，t-c-Jun，p-c-Jun，t-STAT3，p-STAT3，t-p65，p-p65和GAPDH抗體(Abcam，美國)；RIPA和PMSF(北京索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；實驗所需超純水用Millipore Elix新鮮制備(Millipore，美國)。

1.3 動物分組與實驗干預(yù)

取15只成年雄性小鼠隨機分為對照組(n=5)和實驗組(n=10)。對照組常規(guī)飼料喂養(yǎng)(Ctrl)，實驗組給予0.05% ANIT(每日劑量估計為75 mg/kg)飼料食飼，實驗期間采取尾靜脈取血檢測其生化指標(biāo)。實驗組在干預(yù)14 d時處死其中第一批小鼠5只，取其血清、肝臟、膽囊標(biāo)本，實驗結(jié)果標(biāo)記為-荼異硫氰酸酯-14 d組(ANIT-Day14; A-D14)；實驗組剩余5只小鼠繼續(xù)ANIT飼料喂養(yǎng)至第28日結(jié)束，處死小鼠并收集血清、肝臟、膽囊等樣本，實驗結(jié)果標(biāo)記為-荼異硫氰酸酯-28 d組(ANIT-Day28; A-D28)。

1.4 標(biāo)本采集與保存

各組小鼠處死時均稱量體重，小鼠麻醉后進行眼球取血用于生化分析。脫頸處死后取新鮮肝臟和膽囊稱重，并切取最大肝葉用磷酸鹽緩沖液洗滌，然后固定在10%中性福爾馬林溶液中。將剩余的肝組織立即在干冰中冷凍，并置于-80°C冰箱長期保存，用于Q-PCR和蛋白質(zhì)分析。

1.5 血清生化指標(biāo)檢測

使用酶標(biāo)儀通過速率法測定血清總膽汁酸(total bile acid，TBA)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，操作過程依據(jù)試劑盒中的描述進行。

1.6 肝臟組織病理學(xué)分析

肝臟組織在10%福爾馬林溶液中固定24 h后切取2 mm組織塊，對其進行梯度脫水、浸蠟、透明和包埋；包埋完全的石蠟塊4 μm厚度連續(xù)切片，并進行天狼星紅-蘇木素染色(Sirius Red-Hematoxylin Staining)后中性樹膠封片；最后使用顯微鏡(Olympus BX43)觀察肝臟形態(tài)變化。

1.7 肝臟炎癥及纖維化因子的轉(zhuǎn)錄分析

稱取(20±2) mg凍存肝臟組織，在500 μl TRIzol中完全裂解，勻漿、離心、沉淀、洗滌和溶解后測量RNA的濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，方法如文獻所述[13]。 用含有1 μl cDNA，2.2 μl UltraSYBR混合物，0.1 μl引物和1.6 μl雙蒸水的5 μl體系在384孔板上進行定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)擴增(表1)。

Tab. 1 The primers used for the Q-PCR assessment in this study

1.8 蛋白印跡分析

另取凍存肝臟組織(20±2) mg，在含有1%PMSF的RIPA中完全裂解，然后充分勻漿。4℃、 13 000 r/min離心20 min后收集上清液。蛋白質(zhì)定量后，將等體積的5× SDS-PAGE上樣緩沖液與蛋白質(zhì)混合后煮沸8 min。上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，隨后使用5%脫脂奶粉封閉3.5 h。將經(jīng)TBST清洗后的膜與一抗在4～8℃冷房過夜，第2日取出用TBST洗滌，在室溫下二抗孵育2 h。TBST再次洗滌后將ECL化學(xué)發(fā)光液對膜進行處理，并通過化學(xué)成像發(fā)光系統(tǒng)曝光，記錄圖像。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ANIT對小鼠膽汁淤積和肝功能的影響

ANIT飼料喂養(yǎng)14 d和28 d小鼠膽囊相對重量明顯增加，與Ctrl組有明顯的差異(P<0.05，表2)，而肝臟相對重量增長無明顯差異。實驗過程中給予ANIT飼料喂養(yǎng)的小鼠，TBA、ALP、AST、ALT水平始終高于Ctrl組。膽汁淤積性指標(biāo)TBA在14、21、28 d分別升高8.9、4.7、7.2倍，ALP相應(yīng)升高4.4、 3.7、5.4倍。指示肝損傷的指標(biāo)AST與ALT則在14和28 d分別升高9.2、3.9倍和8.1、6.4倍(P< 0.05，表3)。這些結(jié)果表明小鼠膽汁淤積嚴(yán)重，并且有肝損傷發(fā)生。

Tab. 2 Gallbladder change of cholestasis after induction of cholestasis by ANIT (%， n=5)

Tab. 3 Serum biochemical analysis of cholestasis after ANIT treatment n=5)

2.2 肝纖維化基因表達及關(guān)鍵蛋白的變化

在纖維化因子基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitors of metalloproteinases 1,TIMP-1)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、單核細胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)、I型膠原蛋白(collagen protein I,CollagenI)、α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的轉(zhuǎn)錄分析中，給予ANIT 14 d后A-D14組中MMP-2明顯高于對照組，但在A-D28組中約下降至A-D14的50%。TIMP-1和MCP-1升高幅度較大，實驗組14 d時分別升高28和46倍，28 d時基因表達繼續(xù)大幅上調(diào)。CollagenI在實驗組中的表達量的變化與MMP-2類似，A-D14組呈明顯上調(diào)改變，A-D28組又有所降低。CTGF始終保持在高于對照組2～3倍左右的范圍(P<0.05，表4)。

蛋白印記實驗的結(jié)果及條帶灰度分析結(jié)果顯示，與Ctrl組相比較，經(jīng)過ANIT喂養(yǎng)的小鼠中Collagen I和α-SMA兩種蛋白在14 d就已被顯著激活。28 d的灰度圖顯示A-D28組中Collagen I蛋白表達量稍有上升，而α-SMA則有所降低，但與對照組的差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

Tab. 4 Gene expression levels of liver fibrosis n=5)

Fig. 1 Analysis of the degree of liver fibrosis n=5)

2.3 肝臟組織病理學(xué)改變

肝組織鏡下觀察，Ctrl組小鼠肝組織病理表現(xiàn)正常，未有壞死灶，且未產(chǎn)生纖維化。A-D14組小鼠肝組織膠原纖維大量沉積，肝臟壞死區(qū)域增多。A-D28組肝組織壞死灶的數(shù)量相對有所減少，但肝纖維化沉積程度呈現(xiàn)上升趨勢(圖2)。

Fig. 2 Pathological evolution of liver fibrosis (Sirius Red - Hematoxylin Staining ×40)

2.4 炎癥因子的表達及炎癥通路的激活

在肝臟組織中，炎癥因子白細胞介素1β、10、6(Interleukin-1β、10、6;IL-1β、10、6)mRNA水平在ANIT干預(yù)組A-D14和A-D28組中顯著上升。A-D14與對照組相比IL-1β、10、6表達量明顯升高約3.5倍左右。ANIT繼續(xù)作用14 d后，A-D28組IL-1β、IL-10、IL-6表達量仍舊持續(xù)上升，并且IL-1β和IL-10要高于A-D14組(P<0.05，表5)。與Ctrl組相比，A-D14組和A-D28組的JNK、STAT3、c-Jun表達量在ANIT干預(yù)組中有顯著上調(diào)。而無論是t-p65還是p-p65蛋白表達在ANIT干預(yù)條件下都沒有上調(diào)，p-p65甚至稍有下調(diào)(圖3)。上述結(jié)果表明膽汁淤積性肝纖維化產(chǎn)生過程中伴隨炎癥的發(fā)生，JNK通路被激活，NF-κB通路在膽汁淤積性肝纖維化發(fā)生發(fā)展中未發(fā)揮作用。

Tab. 5 The mRNA expression changes of related inflammatory factors n=5)

3 討論

膽汁淤積可以通過ANIT、膽管結(jié)扎和四氯化碳等方式誘導(dǎo)。大鼠膽汁淤積性肝纖維化模型中，膽管結(jié)扎造模4周時見大量膠原組織沉積，ALT從(45.85±4.18)上升至(87.71±7.92)，AST從(42.86±13.18)上升至(78.71±7.87)，纖維組織增生明顯[14, 15]。四氯化碳造模8周時，ALT從(39.0±7.52)上升至(3473.4±1669.29)，AST從(125.8±8.79)上升至(4222.8±1034.24)，膠原蛋白含量上升，膠原纖維沉積[16, 17]。上述兩種方法建立的肝纖維化模型具有簡便易行、病變典型的特點。但膽管結(jié)扎通過手術(shù)易造成器官機械性損傷，而且其膽汁淤積為肝外膽汁淤積；四氯化碳則存在較高的死亡率，劑量過高可能會提前發(fā)展為肝硬化，且該模型本質(zhì)上是化學(xué)性肝損傷模型，而非單純的膽汁淤積性肝纖維。

Fig. 3 Western blot analysis of inflammatory pathway n=5)

ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積在病理和生理反應(yīng)中最接近人類肝內(nèi)膽汁淤積，ANIT(50、75 mg/kg)常用來構(gòu)建24、48 h的急性膽汁淤積模型[18-20]。但嚙齒類動物的修復(fù)能力極強，單劑量造模很難形成慢性肝纖維化模型。而臨床中真實常見是慢性膽汁淤積性肝病誘發(fā)的肝纖維化，因此研究慢性膽汁淤積性肝纖維化更具臨床指導(dǎo)意義。本實驗通過含 0.05% ANIT的飼料喂飼小鼠，建立慢性膽汁淤積性肝纖維化模型。在干預(yù)第2周，TBA、ALP、AST、ALT均顯著升高，雖沒有四氯化碳改變的程度劇烈，但僅僅造模2周時間，膽汁淤積、肝纖維化標(biāo)志物水平明顯上調(diào)，病理清楚顯示有大量膠原沉積，表明在小鼠此時成功被誘導(dǎo)產(chǎn)生膽汁淤積性肝纖維化。

與對照組比較，本實驗中纖維化因子MMP-2和CollagenI基因表達在A-D28干預(yù)組中雖仍呈現(xiàn)上調(diào)改變，但與A-D14組相比卻有降低，存在統(tǒng)計學(xué)上的差異。而α-SMA的mRNA表達各組之間沒有明顯變化，但是其蛋白表達在實驗組中有顯著上調(diào)，也呈現(xiàn)在A-D28組比A-D14 組表達量稍低的改變。這種現(xiàn)象的發(fā)生可能在由于纖維化發(fā)展過程中小鼠自身修復(fù)有關(guān)。有實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素調(diào)節(jié)血紅素加氧酶-1的活性改善膽管結(jié)扎造成的肝纖維化，吡非尼酮促進膠原降解而減少細胞外基質(zhì)的合成、降低α-SMA基因表達從而對于四氯化碳引起的肝纖維化有一定的治療作用[21, 22]。JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路中的一條，它在細胞周期、生殖、凋亡和細胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用，在受到刺激后使相應(yīng)基因表達發(fā)生改變。而本研究結(jié)果顯示，膽汁淤積性肝纖維化過程中的相關(guān)炎癥基因以及蛋白表達與JNK通路有關(guān)，因此在肝纖維化的發(fā)展進程中抑制該通路預(yù)期可以減輕纖維化程度，減緩肝纖維化發(fā)展進程。

綜上所述，本研究結(jié)果表明喂飼含0.05%ANIT的飼料2周即可建立小鼠膽汁淤積性肝纖維化模型，JNK信號通路持續(xù)和穩(wěn)定激活對肝纖維化的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要貢獻，可能成為膽汁淤積性肝纖維化的治療靶點。