沈金花，陳春發(fā)

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物研究所&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

CRISPR(clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)系統(tǒng)是細(xì)菌降解入侵的外源DNA的一種免疫機(jī)制，CRISPR 系統(tǒng)可分為三類(lèi)：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[1].在化膿鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型 CRISPR/Cas9系統(tǒng)組分較簡(jiǎn)單，操作起來(lái)較容易，應(yīng)用最為廣泛，是目前研究的熱門(mén)工具. KARVELIS T等[2]在不影響該系統(tǒng)剪切效率的前提下，將crRNA和tracrRNA合二為一成sgRNA(single guide RNA),在此基礎(chǔ)上，由Cas9蛋白和sgRNA 共同組成CRISPR/Cas9系統(tǒng). CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用時(shí)先由sgRNA靶向預(yù)設(shè)的DNA切割位點(diǎn)前的一段序列，Cas9蛋白切割DNA造成DNA雙鏈斷裂(DSB, double strand break)[3].DNA損傷后細(xì)胞啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制主要有兩種：一是同源介導(dǎo)的DNA修復(fù)(HR, homology-directed repair)，這種機(jī)制可實(shí)現(xiàn)例如：基因敲進(jìn)、基因條件性敲除、基因替換等基因組的精確編輯；二是低保真性的非同源末端連接(NHEJ，non-homologous end joining)，該機(jī)制在修復(fù)過(guò)程中非常容易發(fā)生DNA上的堿基缺失或插入而造成移碼突變，最終該基因不能正常翻譯成蛋白達(dá)到基因敲除的目的[4-5].

PTPMT1是一種定位于線粒體的蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)的雙特異性蛋白酪氨酸磷酸酶活性[6].它通過(guò)琥珀酸脫氫酶的過(guò)度磷酸化作為底物在體內(nèi)起葡萄糖體內(nèi)平衡的調(diào)節(jié)作用[7]. PTPMT1的缺陷會(huì)影響細(xì)胞代謝，這對(duì)于干細(xì)胞的維持和分化至關(guān)重要[8-9].已有研究表明PTPMT1在胰腺β細(xì)胞中的下調(diào)可增加細(xì)胞ATP水平和胰島素的產(chǎn)生.在癌細(xì)胞中，PTPMT1缺失導(dǎo)致細(xì)胞死亡的代謝危機(jī)[10]. PTPMT1的缺失導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞的分化阻滯進(jìn)而導(dǎo)致胚胎發(fā)育性停滯和植入后致死[11].以上的研究表明：PTPMT1在細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞增殖等方面有重要作用，然而在非小細(xì)胞肺癌中的作用尚不明確.磷酸酶MTMR14的敲減會(huì)影響A549細(xì)胞細(xì)胞的增殖[12]，但不知同樣是磷酸酶的PTPMT1在A549中減少的是否會(huì)影響細(xì)胞增殖.基于此，本文利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在A549細(xì)胞中敲減基因PTPMT1，進(jìn)而研究該基因的敲減對(duì)A549細(xì)胞功能的影響，為進(jìn)一步探究非小細(xì)胞肺癌的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑

Real-Time PCR系統(tǒng)(7500Fast，Applied Biosystems)；酶標(biāo)儀(Infinite200，TECAN)；超微量分光光度計(jì)(Nanodrop2000,Thermo Fisher Scientific).

人源肺癌細(xì)胞A549(Procell)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶、雙抗(HyClone)；血清(Sciencell)；質(zhì)粒PX458、Stbl3感受態(tài)、Fast DigestBpiI、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific)；10X T4 Ligation Buffer、10X Fast Digest Buffer、Fast AP、T4 PNK、T4連接酶(武漢淼靈生物)；10X PCR Buffer(TaKaRa)；去內(nèi)毒素小提試劑盒、凝膠回收試劑盒(世紀(jì)康為)；anti-PTPMT1、DTT (BIOSHARP)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、PMSF、蛋白Marker、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG (碧云天)；Lipo-3000、TRIzol Reagent(Invitrogen)；SYBR Green(TOYOBO)；引物合成和測(cè)序(武漢擎科生物).

1.2 基因敲減A549細(xì)胞株的構(gòu)建

1.2.1 選擇載體質(zhì)粒和設(shè)計(jì)sgRNA序列

在張鋒實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站上根據(jù)基因PTPMT1的外顯子序列設(shè)計(jì)sgRNA，通過(guò)系統(tǒng)評(píng)分選擇6對(duì)sgRNA序列(見(jiàn)表1).選擇帶有熒光標(biāo)記、抗性篩選標(biāo)記、插入位點(diǎn)、Cas9序列的PX458作為載體質(zhì)粒，其序列分析見(jiàn)圖1.

表1 PTPTM1 sgRNA序列

圖1 PX458結(jié)構(gòu)分析

1.2.2 PX458-sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

環(huán)形質(zhì)粒PX458用Fast DigestBbs1酶切，跑瓊脂糖凝膠后切膠回收得到酶切開(kāi)的質(zhì)粒.在酶切位點(diǎn)插入設(shè)計(jì)的sgRNA得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，涂平板于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日挑取單菌落后擴(kuò)大培養(yǎng)搖菌，菌液測(cè)序驗(yàn)證sgRNA是否正確地插入到打靶載體上.成功建立PX458-sgRNA表達(dá)載體后，搖菌提質(zhì)粒備用.

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及流式細(xì)胞儀分選

取出1 d前已鋪好的6孔板，細(xì)胞狀態(tài)良好且密度達(dá)到70%～80%即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成無(wú)血清的培養(yǎng)液饑餓1 h.轉(zhuǎn)染時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)液換回含血清的培養(yǎng)液，配制轉(zhuǎn)染體系A(chǔ)：Opti-MEM，125 μL；重組質(zhì)粒，2.5 μg；P3000，5 μL.轉(zhuǎn)染體系B：Opti-MEM，125 μL；Lipo-3000，3.75 μL.混合A、B液，均勻滴加到A549細(xì)胞中.根據(jù)Lipo-3000使用說(shuō)明按一定比例稀釋PX458-sgRNA表達(dá)質(zhì)粒載體，均勻滴加到A549細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀將帶熒光的細(xì)胞分選到96孔板中培養(yǎng)，每個(gè)孔一個(gè)細(xì)胞.

1.2.4 細(xì)胞基因敲除情況的鑒定

單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取基因組通過(guò)PCR獲得大量基因片段后測(cè)序鑒定，通過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)基因組的編輯情況.選擇有移碼突變的細(xì)胞株擴(kuò)培后提蛋白，Western Blotting檢測(cè)PTPMT1蛋白的表達(dá).將基因組被編輯的細(xì)胞系擴(kuò)培提RNA，用Real-Time PCR檢測(cè)PTPMT1mRNA的表達(dá).最后選出兩株敲減細(xì)胞株用以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.3 MTT分析

分別接種敲減細(xì)胞和野生型細(xì)胞1000個(gè)/孔于96孔板中，以每孔培養(yǎng)液200 μL培養(yǎng)，每組6個(gè)平行孔，連續(xù)檢測(cè)5 d，培養(yǎng)終止前4 h加入MTT，4 h后去除培養(yǎng)基，150 μL DMSO充分溶解結(jié)晶紫后設(shè)定酶標(biāo)儀在490 nm檢測(cè)每組細(xì)胞的OD值.

1.4 流式細(xì)胞儀分析

收集一個(gè)6 cm培養(yǎng)皿的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗1次，1800 r·min-1離心5 min后棄去上清，加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇后將細(xì)胞吹散成單細(xì)胞，-20 ℃過(guò)夜固定細(xì)胞.次日以1500 r·min-1離心細(xì)胞5 min，留沉淀，PBS洗2次后加入500 μL PI染色液，冰上反應(yīng)30 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化.

1.5 熒光定量PCR

提取PTPMT1敲減細(xì)胞和野生型細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后用 Real-Time PCR檢測(cè)敲減細(xì)胞RNA水平的變化.

1.6 Western Blotting

提取敲減細(xì)胞和野生型細(xì)胞的總蛋白，測(cè)蛋白濃度后于-80 ℃?zhèn)溆?用SDS-聚丙烯酰胺凝膠跑電泳，蛋白上樣量80 μg，濃縮膠80 V/40 min，分離膠100 V /1.5 h，然后轉(zhuǎn)膜，200 mA冰上濕轉(zhuǎn)50 min.轉(zhuǎn)膜完成后，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，封閉完成后用TBST洗3次，每次10 min，4 ℃孵一抗過(guò)夜后用TBST洗膜3次，室溫孵1 h二抗后用TBST洗3次即可顯影.

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 7、CorelDRAW X4、Microsoft office和FlowJo-V10繪圖，T-test檢驗(yàn)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差.

2 結(jié)果

2.1 PX458-sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，涂平板于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后挑取單菌落后擴(kuò)大培養(yǎng)搖菌，菌液測(cè)序結(jié)果表明：PX458載體分別與6對(duì)sgRNA連接.以其中一對(duì)sgRNA插入PX458載體為例，結(jié)果見(jiàn)圖2. 由圖2可知：測(cè)序結(jié)果的峰圖為單一、干凈的峰，陰影部分為插入的、正確的sgRNA序列載體無(wú)突變，敲除表達(dá)載體構(gòu)建成功.

圖2 構(gòu)建敲除表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果

2.2 構(gòu)建PTPMT1基因敲減的A549細(xì)胞系

選擇肺腺癌中的A549細(xì)胞株作為研究對(duì)象.將測(cè)序正確的PX458-sgRNA表達(dá)載體通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，經(jīng)熒光篩選后單克隆細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，轉(zhuǎn)到中皿培養(yǎng)后，提細(xì)胞基因組PCR后測(cè)序鑒定細(xì)胞編輯情況，測(cè)序發(fā)現(xiàn)改造后的細(xì)胞株基因PTPMT1中有不同程度的堿基替換、缺失和插入；接著用Western Blotting檢測(cè)PTPMT1蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)有多株細(xì)胞PTPMT1表達(dá)量下降，其中sg2-2和sg6-1變化最多，分別減少了70%和80%；用RT-PCR檢測(cè)PTPMT1mRNA表達(dá)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果與WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可見(jiàn)：細(xì)胞株sg2-2和sg6-1這2株細(xì)胞的基因均被編輯了，在蛋白層面來(lái)看細(xì)胞株sg2-2和 sg6-1的PTPMT1明顯減少，而且細(xì)胞株sg2-2和sg6-1的PTPMT1mRNA表達(dá)量也有明顯的減少，減少超過(guò)2/3認(rèn)為PTPMT1基因穩(wěn)定敲減的A549細(xì)胞系構(gòu)建成功.

與A549組相比，*P<0.05, ** P<0.01

2.3 PTPMT1 表達(dá)量的減少導(dǎo)致A549 的細(xì)胞存活率降低

研究表明：在HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)中PTPMT1的缺失會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[10]，猜測(cè)PTPMT1的減少也會(huì)影響肺癌細(xì)胞A549的增殖，進(jìn)行為期5 d的MTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.由圖4可知：PTPMT1的減少導(dǎo)致A549細(xì)胞的存活率降低.

與A549組相比，** P<0.01, *** P<0.001

2.4 A549非同步化細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞周期的阻滯密切影響細(xì)胞增殖[13-14].用PI染色經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)探究PTPMT1基因敲減對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期的具體影響.由圖5和表2可知：在細(xì)胞非同步情況下，野生型和基因敲減的細(xì)胞處于G1、G2、S時(shí)期的數(shù)目無(wú)顯著性差異故而PTPMT1基因敲減對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期無(wú)明顯影響.

a) 對(duì)照組A549；b) 敲減細(xì)胞株sg2-2；c) 敲減細(xì)胞株sg6-1

表2 細(xì)胞周期流式分析

2.5 熒光定量 PCR 檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄水平

細(xì)胞增殖受細(xì)胞周期的影響，而周期調(diào)控因子嚴(yán)密調(diào)控著細(xì)胞周期的進(jìn)程，選擇CyclinD1、CyclinE這兩個(gè)促進(jìn)細(xì)胞增殖的正調(diào)控因子和P21、P27這兩個(gè)抑制細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控因子，在mRNA表達(dá)水平檢測(cè)相關(guān)周期調(diào)控因子的變化.結(jié)果見(jiàn)圖6.如圖6所示，細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子P27mRNA表達(dá)水平顯著升高.

與A549組相比，*P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001

3 討論

PTPMT1是特異性定位于線粒體的雙特異性磷酸酶，它錨定在線粒體內(nèi)膜中，其磷酸酶結(jié)構(gòu)域暴露于基質(zhì)，使其接近許多負(fù)責(zé)能量生成和代謝的酶[15].PTPMT1作為哺乳動(dòng)物磷脂酰甘油磷酸脂(PGP)脂質(zhì)磷酸酶起作用，催化心磷脂生物合成途徑的倒數(shù)第二步，可直接影響線粒體的脂質(zhì)部分[16].心磷脂的穩(wěn)態(tài)擾動(dòng)與細(xì)胞凋亡有關(guān).心磷脂是專(zhuān)門(mén)在線粒體內(nèi)合成和利用，已知該途徑的其他關(guān)鍵合成酶錨定在線粒體內(nèi)膜中，研究表明線粒體膜內(nèi)的心磷脂與細(xì)胞色素c結(jié)合，該脂質(zhì)的氧化對(duì)于細(xì)胞色素c的釋放和隨后的線粒體依賴(lài)性凋亡所必需[17].已有研究表明PTPMT1缺陷會(huì)影響細(xì)胞代謝，這對(duì)于造血干細(xì)胞的維持和分化至關(guān)重要[8-9].而在胚胎干細(xì)胞中PTPMT1的缺失會(huì)導(dǎo)致其死亡[13]，在人乳腺癌細(xì)胞中，PTPMT1缺失導(dǎo)致細(xì)胞死亡的代謝危機(jī)[10].

原發(fā)性支氣管肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)全球肺癌的發(fā)病率和死亡率一直居高不下并呈上升態(tài)勢(shì)[18].在中國(guó)，肺癌一度成為導(dǎo)致人類(lèi)因癌癥死亡的首要疾病[19].非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌的80%，許多患者發(fā)現(xiàn)患病時(shí)已處于中晚期，5年生存率很低，因此更需要深層次、多方面地研究該病的發(fā)病機(jī)理和潛在的治療靶點(diǎn).肺腺癌(lung adenocarcinoma)是肺癌的一種，屬于非小細(xì)胞癌. A549細(xì)胞是腺癌人類(lèi)肺泡基底上皮細(xì)胞，故本文選用A549細(xì)胞作為研究對(duì)象，研究PTPMT1的減少對(duì)A549細(xì)胞功能的影響.

本文基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立了基因PTPMT1穩(wěn)定敲減的A549細(xì)胞株，從DNA、RNA和蛋白三個(gè)層面檢測(cè)了Knockdown細(xì)胞系的基因編輯情況，結(jié)果顯示PTPMT1減少了70%～80%.為研究PTPMT1減少對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)記錄5 d WT細(xì)胞和KD細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示：與WT細(xì)胞相比兩株KD細(xì)胞的增殖被抑制，基因PTPMT1敲減得多一些的sg6-1株細(xì)胞生長(zhǎng)減緩得更明顯.為研究肺癌早期診斷及靶向治療提供理論基礎(chǔ).進(jìn)一步研究KD細(xì)胞生長(zhǎng)減緩的原因，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞非同步化的條件下，WT細(xì)胞相比兩株KD細(xì)胞各時(shí)期細(xì)胞的比例基本相當(dāng)，細(xì)胞周期無(wú)明顯變化，細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子P27在兩株KD細(xì)胞中明顯上調(diào).

P27是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，主要通過(guò)以下兩個(gè)途徑抑制細(xì)胞周期進(jìn)程：抑制CDK激活和抑制激活后的Cyclin-CDK活性[20].P27對(duì)G1期Cyclin-CDK抑制作用最為重要，它能顯著抑制Cyclin E-CDK2和Cyclin E-CDK4復(fù)合物的活性，使細(xì)胞周期停滯于G1期和S期的轉(zhuǎn)換，是G1期限速因子[21].兩株KD細(xì)胞的細(xì)胞周期被部分阻滯在G1期，因此細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯減緩.

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)：基因PTPMT1的敲減上調(diào)了細(xì)胞周期調(diào)控因子P27，進(jìn)而導(dǎo)致A549細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減緩.說(shuō)明PTPMT1的減少會(huì)導(dǎo)致肺癌A549細(xì)胞產(chǎn)生代謝危機(jī)，影響其細(xì)胞增殖.但PTPMT1敲減影響細(xì)胞周期調(diào)控因子P27變化的具體機(jī)制還需要更進(jìn)一步研究.